母鼠摄入BPA对子代AHR mRNA表达和Th17细胞的影响

房 魏，李 云，李应配，蒋建华，朱启星，沈 彤，

◇预防医学研究◇

母鼠摄入BPA对子代AHR mRNA表达和Th17细胞的影响

房 魏1，李 云1，李应配1，蒋建华2，朱启星3，沈 彤1，3

目的研究母鼠围生期经饮水摄入低剂量双酚A （BPA）对子代芳香烃受体（AHR）和辅助性T（Th）17细胞的影响。方法将确认妊娠的ICR母鼠随机分成空白对照组和溶剂对照组、10、100和1 000 nmol／L BPA组；母鼠自妊娠第0天（GD 0）至仔鼠出生后第21天（PND 21）经饮水摄入BPA。PND 21时处死仔鼠，取血用ELISA法测血清白细胞介素（IL）-17和IL-23含量，取脾脏，流式细胞术检测Th17细胞比例，实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测维甲酸相关孤核受体γt（RORγt）和AHR mRNA表达水平。结果与空白对照组比较，各BPA剂量组母鼠孕期体重、仔鼠出生和PND 21时体重、窝仔数差异均无统计学意义；100和1 000 nmol／L BPA组仔鼠PND 21时脾脏Th17细胞比例均显著升高（P＜0.05），脾脏RORγt mRNA和AHR mRNA表达水平明显上调（P＜0.01），血清IL-17和IL-23含量也明显上升（P＜0.01）；脾脏Th17细胞比例和RORγt mRNA表达水平与AHR mRNA表达水平均呈正相关性（P＜0.01）。结论围生期母鼠暴露于低剂量BPA可导致子代断乳时AHR表达上调，并经RORγt途径促进Th17细胞发育。

双酚A；芳香烃受体；Th17；免疫发育毒性

环境内分泌干扰物双酚A（bisphenol A，BPA）是世界范围内大量生产使用的工业原料，广泛应用于食品饮料包装、牙科密封剂等塑料制品生产［1］。流行病学资料［2］提示人类广泛暴露于环境BPA污染。生命早期的暴露会对出生后机体免疫系统产生长久的影响，如减少调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的数量［3－4］。辅助性T（T helper，Th）17细胞是近年来新发现的一种效应T细胞亚群，其分化依赖于特异性转录因子维甲酸相关孤核受体（retinoic acid related orphan receptor，ROR）γt的表达，主要通过分泌白细胞介素（interleukin，IL）-17、IL-23、IL-6等炎性细胞因子而发挥促炎作用［5］。研究［6－7］表明配体激活转录因子芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）以配体依赖的方式调节Th0细胞向Treg或Th17细胞分化。然而，围生期BPA暴露对出生后Th17细胞和AHR的影响，以及其中Th17细胞和AHR的关系目前还不清楚。该研究通过动物实验，探讨母鼠围生期经水摄入低剂量BPA对子代断乳时Th17细胞和AHR表达的影响，并分析两者之间的关系，为阐明BPA发育免疫毒性机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂BPA（99.9%分析纯）（国药集团化学试剂北京有限公司）；二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美国Sigma公司）；藻红蛋白（phycoerythrin，PE）-anti-CD4抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-anti-IL-17抗体（美国Biolegend公司）；RNA提取纯化试剂盒RNeasy Mini Kit（德国QIAGEN公司）；逆转录试剂盒PrimeScript®RT Master Mix、实时PCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ［宝生物工程（大连）有限公司］；IL-17和IL-23 ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；EPICS XL-MCL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；Applied Biosystems 7500实时PCR仪（美国AB公司）；Universal 320R型台式低温高速离心机（德国Hettich公司）；Elx 800 TM酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 实验动物及处理SPF级ICR 8周龄雌鼠和9周龄雄鼠，购自安徽省实验动物中心，饲养于清洁级动物房，自由进食，保持12 h光照／12 h黑暗的昼夜节律。适应性饲养1周后，雌∶雄按2∶1合笼，次日清晨查到阴栓定为妊娠第0天（gestational day，GD 0）。孕鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、10、100、1 000 nmol／L BPA组，其中1 000 nmol／L BPA组5只，其余每组均为4只。孕鼠自GD 0至断乳，即子代出生后第21天（postnatal day，PND 21）经饮水暴露BPA。每天记录母鼠一般情况和饮水量，每周称重1次。记录子代出生情况，仔鼠每周称重1次。PND 21时，眼球摘除法收集仔鼠外周血，分离血清；处死仔鼠，无菌操作下取脾脏。

1.3 流式细胞术检测仔鼠脾脏CD4＋T细胞中Th17细胞比例取仔鼠脾脏组织约0.3 g，剪碎，200目不锈钢筛过滤，PBS冲洗制成单细胞悬液；1 500 r／min离心10 min，弃上清液；台盼蓝染色活细胞计数，细胞活力大于90%时用于实验；用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640培养液调整密度至8×107个／L。取200 μl悬液（约106个细胞）加至培养板，加入20 μl莫能菌素（0.1 μg／ml）、50 μl佛波醇乙酯（1 μg／ml）和5 μl离子霉素（50 μg／ml），37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，1 500 r／min离心5 min，弃上清液，振荡均匀；加入0.5 μl PE-anti-CD4，避光静置10 min行细胞外染色，加入50 μl固定剂和打孔剂进行固定和打孔，再加入1 μl FITC-anti-IL-17避光孵育30 min行细胞内染色，24 h内测定Th17细胞数量，使用FCS Express V3软件分析，结果以Th17细胞占CD4＋细胞的比例表示。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）测脾脏RORγt和AHR mRNA表达水平将新鲜脾脏制成匀浆，用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，PrimeScript®RT Master Mix试剂盒逆转录为cDNA，在Applied Biosystems 7500实时PCR仪上用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行扩增，扩增条件：第一步：95℃30 s；第二步（40个循环）：95℃变性5 s，60℃退火34 s，扩增完成后从60℃开始升温作熔解曲线验证产物的特异性。以GAPDH作为内参，2－ΔΔCt法分析RORγt、AHR和内参基因相对表达水平。引物序列如下，RORγt上游引物：5′-CCGCTGAGAGGGCTTCAC-3′，下游引物：5′-TGCAGGAGTAGGCCACATTACA-3′；AHR上游引物：5′-CGCCTCCGGGACGCAGGTGG-3′，下游引物：5′-AAAGAAGCTCTTGGCCCTCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′，下游引物：5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

1.5 ELISA法测定血清IL-17和IL-23含量用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-17和IL-23的含量，按试剂盒说明书操作。酶标仪450 nm波长下测吸光度（optical density，OD）值，用标准曲线计算结果。

1.6 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，数据用±s表示。多组间均数比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间的比较采用LSD法，相关分析用线性Pearson相关。

2 结果

表1 饮水摄入不同剂量BPA母鼠孕期体重（g，±s）

表1 饮水摄入不同剂量BPA母鼠孕期体重（g，±s）

时间空白对照组（n＝4）溶剂对照组（n＝4）BPA组10 nmol／L（n＝4）100 nmol／L（n＝4）1 000 nmol／L（n＝5）F值P值GD 032.68±2.8631.60±1.2131.78±4.0832.83±2.0031.98±1.720.1880.941 GD 636.13±2.7533.28±2.8734.00±5.2535.10±2.0633.84±1.750.5440.706 GD 1243.23±4.3840.98±2.6642.78±7.2443.08±2.4140.58±4.240.3350.850 GD 1862.40±5.5958.80±3.8464.18±11.3867.05±6.2662.28±10.740.5260.718

表2 BPA暴露母鼠所生子代出生和PND 21时平均窝仔数（只，±s）及仔鼠平均体重（g，±s）

表2 BPA暴露母鼠所生子代出生和PND 21时平均窝仔数（只，±s）及仔鼠平均体重（g，±s）

时间项目空白对照组（n＝4）溶剂对照组（n＝4）BPA组10 nmol／L（n＝4）100 nmol／L（n＝4）1 000 nmol／L（n＝5）F值P值PND 0窝仔数13.50±3.1112.25±2.0615.00±4.9715.00±3.3713.40±3.970.4190.793体重1.54±0.131.60±0.111.53±0.091.57±0.241.58±0.100.1940.938 PND 21窝仔数12.50±2.389.75±2.5011.50±4.2011.25±5.3813.00±3.740.4690.757体重8.86±1.748.89±0.729.41±2.529.04±1.108.99±3.360.0390.997

2.1 一般情况各组母鼠孕期一般情况良好，未出现中毒死亡、流产、死胎和死产现象，不同时点体重差异均无统计学意义（表1）；子代出生和断乳时，各组仔鼠平均窝仔数及平均体重差异均无统计学意义（表2）。

2.2 母鼠饮水摄入BPA对仔鼠PND 21时脾脏Th17细胞数量影响用PE-anti-CD4和FITC-anti-IL-17抗体标记仔鼠PND 21时脾脏细胞悬液，FCM检测Th17细胞数量，见图1。空白对照组与溶剂对照组比较，仔鼠脾脏Th17数量差异无统计学意义，仔鼠脾脏Th17细胞比例随母鼠BPA暴露剂量的增加而升高；与空白对照组比较，100、1 000 nmol／L BPA组仔鼠脾脏Th17细胞比例升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

2.3 母鼠饮水摄入BPA对仔鼠PND 21时脾脏RORγt mRNA表达水平影响空白对照组与溶剂对照组比较，仔鼠脾脏RORγt mRNA表达差异无统计学意义，仔鼠脾脏RORγt mRNA表达水平随母鼠BPA暴露剂量的增加而上调；与空白对照组比较，100、1 000 nmol／L BPA组仔鼠脾脏RORγt mRNA表达明显上调（P＜0.01）。见表3。

2.4 母鼠饮水摄入BPA对仔鼠PND 21时血清IL-17和IL-23含量影响空白对照组与溶剂对照组仔鼠血清IL-17和IL-23含量差异无统计学意义；仔鼠血清IL-17和IL-23含量均随母鼠BPA暴露剂量的增加而升高，100、1 000 nmol／L BPA组仔鼠血清IL-17和IL-23含量明显高于空白对照组（P＜0.01）。见表4。

表3 母鼠围生期BPA暴露对子代PND 21时脾脏Th17细胞比例（%）和RORγt mRNA表达的影响

表4 母鼠围生期暴露BPA对仔鼠PND 21时血清IL-17和IL-23含量影响（pg／ml，n＝6）

2.5 母鼠围生期饮水摄入BPA对仔鼠PND21脾脏AHR影响各组AHR mRNA表达水平分别为：空白对照组（1.30±0.07），溶剂对照组（1.32± 0.07），10 nmol／L BPA组（1.41±0.06），100 nmol／L BPA组（1.63±0.09），1 000 nmol／L BPA组（1.81±0.07）。空白对照组与溶剂对照组比较，子代脾脏AHR mRNA表达水平差异无统计学意义。AHR mRNA表达水平随母鼠BPA暴露剂量的增加而上调，与空白对照组比较，10 nmol／L BPA组AHR mRNA表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05），100 nmol／L BPA组和1 000 nmol／L BPA组AHR mRNA表达差异更显著（P＜0.01）。

2.6 仔鼠脾脏Th17细胞比例和RORγt mRNA表达水平与AHR mRNA表达水平的相关性仔鼠脾脏Th17细胞比例与AHR mRNA表达水平作相关分析，显示两者呈正相关性且有统计学意义（r＝0.975，P＜0.01）；RORγt mRNA表达水平与AHR mRNA表达水平作相关分析，两者也呈正相关性且有统计学意义（r＝0.998，P＜0.01）。

3 讨论

环境BPA暴露主要通过消化道和皮肤接触等途径，本研究母鼠暴露BPA采用饮水摄入的方式，与人类暴露途径类似。BPA具有弱的雌激素作用，研究［3］显示环境相当剂量BPA暴露可对机体生殖、神经、代谢和内分泌等系统产生不良影响，本研究中母鼠BPA暴露的最高剂量为1 000 nmol／L，按照母鼠每天饮水量5～10 ml计算，每天BPA摄入量最高为45.6 μg／kg，仍低于美国环保署（EPA）规定的参考剂量50 μg。

研究［8］表明出生前BPA暴露可引起机体免疫功能改变，如引起Th2细胞产生的细胞因子减少和Treg数量下降等。Th17细胞主要通过分泌IL-17等参与炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生和发展［5］。Treg与Th17细胞的平衡在维持机体的免疫稳态中发挥重要作用［9］。本研究表明母鼠围生期低剂量BPA暴露可促进子代出生后Th17细胞的发育和功能改变。

RORγt是Th17细胞特征性表达的转录因子，不仅在Th17细胞的分化发育中起着调控作用，还在Th17细胞功能中发挥关键作用［5］。本研究RT-qPCR检测结果显示母鼠围生期BPA暴露可能上调子代RORγt的表达，促进Th17细胞分化发育和功能发挥。

AHR是细胞内一类重要的外源化学物受体和配体活化的转录因子，与配体结合后可诱导靶基因转录。研究［6］显示，AHR还调节Th17细胞的分化发育。本研究显示仔鼠脾脏AHR mRNA随母鼠BPA摄入剂量的增加而上调，提示母鼠围生期环境低剂量BPA暴露可上调子代AHR的表达。这与研究［10］结果一致。相关分析显示仔鼠脾脏AHR mRNA表达水平与Th17细胞比例和RORγt mRNA表达水平均呈正相关性，提示母鼠BPA暴露所致子代AHR表达上调可能在其导致子代Th17细胞比例增加和RORγt表达上调中起着调节作用。

综上所述，母鼠围生期饮水摄入低剂量BPA可能通过上调AHR表达、调控RORγt表达增加、促进仔鼠出生后Th17细胞的分化发育，从而影响仔鼠免疫功能。该结果为环境BPA暴露免疫发育毒性机制提供了一定的实验资料，至于母鼠暴露低剂量BPA诱导AHR上调、调控RORγt表达和Th17细胞分化发育的具体分子作用机制仍需进一步探讨。

［1］ Huang Y Q，Wong C K，Zheng J S，et al.Bisphenol A（BPA）in China：a review of sources，environmental levels，and potential human health impacts［J］.Environ Int，2012，42：91－9.

［2］ Vandenberg L N，Chahoud I，Heindel J J，et al.Urinary，circulating，and tissue biomonitoring studies indicate widespread exposure to bisphenol A［J］.Environ Health Perspect，2010，118 （8）：1055－70.

［3］ Rochester J R.Bisphenol A and human health：A review of the literature［J］.Reprod Toxicol，2013，42：132－55.

［4］ 丁宋军，李 云，房 魏，等.围生期高剂量双酚A暴露对仔鼠生命早期调节性T细胞的影响［J］.安徽医科大学学报，2013，48（1）：26－9.

［5］ Miossec P，Korn T，Kuchroo V K.Interleukin-17 and type 17 helper T cells［J］.N Engl J Med，2009，361（9）：888－98.

［6］ Hayes M D，Ovcinnikovs V，Smith A G，et al.The aryl hydrocarbon receptor：differential contribution to T helper 17 and T cytotoxic 17 cell development［J］.PLoS One，2014，9（9）：e106955.

［7］ Quintana F J，Basso A S，Iglesias A H，et al.Control of T（reg）and T（H）17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor ［J］.Nature，2008，453（7191）：65－71.

［8］ Yan H，Takamoto M，Sugane K.Exposure to Bisphenol A prenatally or in adulthood promotes TH2 cytokine production associated with reduction of CD4CD25 regulatory T cells［J］.Environ Health Perspect，2008，116（4）：514－9.

［9］ Littman D R，Rudensky A Y.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation［J］.Cell，2010，140（6）：845－58.

［10］Nishizawa H，Morita M，Sugimoto M，et al.Effects of in utero exposure to bisphenol A on mRNA expression of arylhydrocarbon and retinoid receptors in murine embryos［J］.J Reprod Dev，2005，51（3）：315－24.

Effects of perinatal maternal exposed to BPA on AHR mRNA expression and Th17 cell of offspring mice

Fang Wei，Li Yun，Li Yingpei，et al
（Dept of Health Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveThe present study was to investigate the effects of low－dose bisphenol A（BPA）exposure by drinking water during perinatal period on aryl hydrocarbon receptor（AHR）and Th17 cells in its offspring.MethodsThe pregnant ICR mice were randomly divided into 5 groups：blank control，vehicle control，10，100 and 1 000 nmol／L BPA groups and exposed to BPA by drinking water from gestational day 0（GD 0）to postnatal day 21（PND 21）.Fetuses were sacrificed on PND 21.The levels of IL-17 and IL-23 in serum were detected by ELISA，and the proportion of Th17 cells in spleen was measured by flow cytometry.RT-qPCR was conducted to detect the mRNA levels of RORγt and AHR in spleen.ResultsAs compared to the control group，the maternal body weight during pregnancy，fetal body weight at birth and PND 21，the number of fetuses per litter，were all found of no significant difference in BPA groups.In fetuses at PND 21 in 100 and 1 000 nmol／L BPA groups，the proportion of Th17 cells in spleen was significantly increased（P＜0.05）；the mRNA levels of RORγt and AHR were markedly raised（P＜0.01）；meanwhile，serum IL-17 and IL-23 were significantly increased（P＜0.01），compared with the control.A positive correlation was observed between the proportion of Th17 cells and the mRNA levels of RORγt，AHR（P＜0.01）.ConclusionPerinatal exposure of BPA at a low dose can increase the level of AHR，and promote the differentiation of Th17 cells through RORγt in offspring after weaning.

bisphenol A；AHR；Th17；developmental immunotoxicity

R 114；R 994.6

A

1000－1492（2015）07－0958－05

2015－03－31接收

国家自然科学基金（编号：81473015）

安徽医科大学公共卫生学院1卫生毒理学系、3职业卫生与环境卫生学系，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院临床营养科，合肥 230022

房 魏，男，硕士研究生；沈 彤，男，博士，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：ahmusht＠163.com