PGE2对LPS诱导小鼠骨髓源性树突细胞成熟及EP4受体表达影响

盛康亮，李 影，付静静，陈镜宇，张玲玲，魏伟

◇基础医学研究◇

PGE2对LPS诱导小鼠骨髓源性树突细胞成熟及EP4受体表达影响

盛康亮*，李 影*，付静静，陈镜宇，张玲玲，魏伟

目的观察不同浓度前列腺素E2（PGE2）刺激对脂多糖（LPS）诱导小鼠骨髓源性树突细胞（DCs）成熟及EP4受体表达的影响。方法采用重组小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）刺激小鼠骨髓源细胞，诱导生成DCs；经LPS（100 ng／ml）诱导成熟后，用不同浓度PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激DCs 24 h，流式细胞术检测DCs表型CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达和抗原摄取功能，荧光间标法检测小鼠骨髓源DCs细胞膜上EP4的表达，以平均荧光强度表示表达的高低；MTT法检测经PGE2及LPS诱导成熟的DCs对T细胞增殖的作用。结果流式细胞术结果显示PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）能明显上调CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达；PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）能明显抑制DCs的抗原摄取功能；MTT法检测结果显示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激DCs能促进T细胞增殖的作用；荧光间标法检测结果显示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）明显升高DCs细胞膜上EP4表达。结论PGE2可以调节DCs功能，该作用可能与其调节EP4受体表达相关。

EP4受体；树突细胞；PGE2

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是花生四烯酸类物质的重要代谢产物，具有较强的免疫活性，可以调节免疫细胞的发育、功能以及存活［1］。前列腺素E2受体（E-prostanoid receptors，EPs）分为4个亚型，即EP1、EP2、EP3和EP4。EP2和EP4受体通过偶联Gs蛋白，激活腺苷酸环化酶，从而增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的水平［2］。PGE2与其不同EP受体结合，促进了白细胞介素（interleukin）6和组胺的释放，影响血管的通透性，导致炎症的发生［3］。研究［4］显示多数免疫细胞均表达EP受体。但研究［5］多集中在巨噬细胞、T淋巴细胞及B淋巴细胞。树突细胞（dendritic cells，DCs）作为目前发现的功能最强大的专职抗原递呈细胞，在参与免疫反应中起重要作用［6］。研究［7］报道，体外培养DCs能产生花生四烯酸产物，特别是PGE2。另有报道［8］PGE2主要通过EP4调节DCs的功能。但不同浓度PGE2对DCs成熟有怎样的调节作用，其对DCs成熟的调节是否通过影响EP4受体的表达来发挥作用，目前未见相关研究。该研究观察不同浓度PGE2对DCs功能的影响以及与EP4表达的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级健康C57BL／6小鼠，雄性，体质量（20±2）g，7～8周龄，购自安徽医科大学实验动物中心，标准化清洁环境中饲养。

1.2 主要试剂重组小鼠白细胞介素4（recombinant IL-4，rmIL-4）、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rm granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）、FITC标记的羊抗兔二抗购自美国Pepretech公司；RPMI-1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；红细胞裂解液购自上海碧云天生物技术研究所；PE标记的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型对照IgG购自美国Biolegend公司；EP4受体一抗购自美国Santa公司；；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、FITC-Dextran（40 ku）购自美国Sigma公司。

1.3 DCs的分离与培养小鼠脱臼处死后，在超净台无菌条件下分离小鼠后肢股骨和胫骨，75%酒精浸泡3 min，用5 ml注射器用PBS反复洗2次；去除骨两端，用5 ml注射器抽取灭菌后的PBS液反复冲洗出骨髓直至骨髓腔变白；用200目纱网过滤冲洗出的骨髓悬液，2 000 r／min离心10 min，弃上清液，根据骨髓细胞数量，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640，细胞数量调整到5×109／L；铺在6孔培养板中，每孔2 ml，置37℃、5%CO2培养箱培养3 h，使得细胞贴壁，3 h更换新鲜培养基，并加入rmGMCSF（终浓度20 μg／L）和rmIL-4（终浓度20 μg／L）；于第3、5天，隔日半量换液，弃去半量上清液，重新加入含10%胎牛血清和rmGM-CSF（20 μg／L）、rmIL-4（20 μg／L）的RPMI-1640培养基。培养至第6天，吹打、收集粘附的细胞，采用流式细胞仪检测相关指标［4］。

1.4 DCs的鉴定

1.4.1 形态学及DCs细胞表型的鉴定 细胞培养至第3、5、7天，分别镜下观察细胞是否具有成簇生长、突起、毛刺等树突细胞特征。收集培养至第7天的细胞，轻轻吹打，收集粘附的细胞，2 000 r／min离心10 min，PBS重悬，调整细胞数量5×106／ml，加入流式管中，每管100 μl。分别加入FITC标记的CD11c（小鼠DCs特异性表面标记物）抗体及同型对照抗体，4℃孵育30 min后，再加入300 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。检测CD11c细胞比例，鉴定DCs并确定相关培养条件。

1.4.2 对DCs的干预 培养至第6天，根据实验需要，设空白对照组、阳性对照组LPS（100 ng／ml）、处理组PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）＋LPS（100 ng／ml），24 h后收集DCs检测相关指标。

1.5 DCs的表型及功能检测

1.5.1 骨髓源DCs表型和EP4表达的检测 细胞培养至第7天，轻轻吹打、收集粘附的细胞，2 000 r／min离心10 min，PBS重悬，调整细胞数量5×106／ml，每管100 μl。DCs表型检测每管细胞分别加入PE标记的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型对照IgG，EP4表达的检测每管细胞加入兔源性抗EP4受体一抗（1∶100），孵育，PBS洗涤，加FITC标记的羊抗兔二抗（1∶250）避光孵育，用仅加入FITC标记的羊抗兔二抗孵育的DCs作为同型对照。4℃避光孵育30 min后，加入300 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。去除非特异性染色后，比较平均荧光强度的变化。流式细胞仪检测，以X轴平均荧光强度的变化表示DCs表型的表达。

1.5.2 DCs摄取功能的检测 细胞培养至第7天，轻轻吹打、收集粘附的细胞，2 000 r／min，离心10 min，PBS重悬，调整细胞数量5×106／ml，培养于1.5 ml EP管中，每管100 μl，加入PBS稀释的FITC-Dextran（终浓度为1 mg／ml），置于37℃温育2 h后取出，PBS洗涤重悬于400 μl PBS中，流式细胞仪检测。其他条件相同4℃孵育作为对照。以X轴平均荧光强度的变化表示DCs的吞噬能力。

1.5.3 混合淋巴细胞反应 超净台内无菌条件下取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，用红细胞裂解液处理，除去红细胞，2 000 r／min离心10 min，弃上清液，采用尼龙毛柱法，去除细胞悬液中的B淋巴细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×106／ml，作为反应细胞。分别以培养至第7天的各处理组DCs为刺激细胞，以25 μg／ml的丝裂霉素C加入刺激细胞中，将其置于CO2培养箱中培养30 min，灭活。将刺激细胞和反应细胞按不同比例混合，加入96孔板中，每组设3个复孔。CO2培养箱培养48 h。MTT法分析DCs对T淋巴细胞的增殖能力的影响。预实验结果显示，刺激细胞和反应细胞（1∶10）比例混合具有刺激T淋巴细胞增殖的能力。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，数据以±s表示。组间比较用方差分析。

2 结果

2.1 DCs的培养与鉴定小鼠骨髓细胞经rmGMCSF和rmIL-4刺激，培养3 d后，细胞成簇生长。第5天，多数细胞呈悬浮状，可见突起，呈毛刺状。收集培养至第7天的细胞，用于后续实验。

2.2 PGE2对DCs表型及功能的影响

2.2.1 PGE2对DCs表面分子CD40、CD83、MHC-Ⅱ表达的影响 与LPS（100 ng／ml）组比较，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）组能明显上调CD40、MHC-Ⅱ的表达（P＜0.01）；PGE2（2.5、5 nmol／L）组能明显上调CD83的表达（P＜0.01）；PGE2（0.625、20 nmol／L）对CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达均无明显影响，所有剂量组对CD80均无明显影响，见图1。

2.2.2 PGE2对DCs抗原摄取能力的影响 与LPS （100 ng／ml）组比较，PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激组DCs的抗原摄取能力明显降低（P ＜0.01），PGE2（0.625 nmol／L）刺激组DCs的抗原摄取能力无变化，见图2。

2.2.3 PGE2处理的DCs对T细胞增殖的影响与LPS（100 ng／ml）组比较，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）处理的DCs能明显增强T细胞增殖（P＜0.01），PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）处理的DCs对T细胞增殖无增强作用，见图3。

2.2.4 PGE2对小鼠DCs表面EP4表达的影响与LPS（100 ng／ml）组比较，刺激组DCs经较高浓度PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激后FITC平均荧光强度均显著增强（P＜0.01），提示PGE2刺激后EP4胞膜表达明显上升。但PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，FITC平均荧光强度无明显变化，EP4胞膜表达无明显变化，见图4。

3 讨论

PGE2调节多种免疫和炎症性过程，如细胞因子的产生，抗体的形成，吞噬和细胞增殖。PGE2有促炎和抗炎双重作用。有报道［9］PGE2通过抑制T细胞增殖和IL-2受体的表达，降低IL-2的释放，发挥抗炎和免疫抑制作用，进而抑制了干扰素-γ的分泌，因此PGE2抑制辅助性T细胞1功能；但Yao et al［10］报道PGE2通过EP4受体作用于T淋巴细胞，促进辅助性T细胞1的分化和辅助性T细胞17的扩增。PGE2在不同的微环境下表现出对DCs功能截然不同的作用。在外周组织中PGE2对DCs有促进作用，诱导其成熟和转移。一旦DCs转移到淋巴器官，PGE2呈现抑制DCs功能，抑制其成熟及抗原的呈递功能。此外，PGE2在不同的促炎因子及免疫细胞作用下也表现出对DCs功能截然不同的作用。PGE2降低IL-12并通过抑制MHCⅡ分子的表达调节抗原呈递。PGE2可以加强DCs的分化并影响辅助性T细胞的能力。PGE2联合促炎因子如IL-1，肿瘤坏死因子-α，IL-6等促进DCs的成熟［11］。

本研究显示不同剂量的PGE2对DCs的功能有不同的作用，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）能促进DCs的成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）对DCs成熟没有明显作用。这种不同浓度的PGE2对DCs功能影响的不同，可能由于其通过不同EP受体诱导不同的细胞内信号途径产生的。实验显示，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）刺激后EP4胞膜表达上升，促进DCs成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，EP4胞膜表达下降，对DCs成熟无作用。研究［10］报道EP4激动剂（ONO-AE1-329）增强DCs表面CD83的表达，促进DCs成熟，而EP1和EP3无明显作用。PGE2作用于DCs可以增强其表面分子CD83的表达，与EP4受体激动剂（ONO-AE1-329）呈现相似的表现。PGE2促进DCs成熟的作用是通过EP4受体调节这一现象，可以用选择性EP4受体拮抗剂（ONO-AE3-208）作用于经过PGE2刺激后的DCs证实。用cAMP类似物模拟PGE2的作用，表明PGE2促进DCs成熟的作用是通过cAMP调节的［12］。不仅EP4在DCs的成熟中发挥作用，还参与了T淋巴细胞功能的调节，T淋巴细胞在缺乏EP1和EP3的情况下一样对PGE2敏感，而在缺乏EP4表达的情况下抵抗PGE2的作用［13］。PGE2通过EP4影响下游Gas蛋白的表达和cAMP水平，进而发挥促进DCs功能的作用［14］。根据这些研究推测，不同浓度PGE2对LPS诱导小鼠骨髓源性DCs成熟的差异与其调节EP4受体的表达的高低有关。

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The effect of prostaglandin E2 on maturation and EP4 expression on dendritic cell induced by LPS

Sheng Kangliang，Li Ying，Fu Jingjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University；Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education；Co-Innovation Center for Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of PGE2 in the different concentrations on the maturation of bone marrow-derived dendritic cells（DCs）of mouse stimulated by LPS and EP4 expression.MethodsThe bone marrow-derived DCs were induced in the presence of recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor （rmGM-CSF）and rmIL-4.Maturated DCs were induced by LPS（100 ng／ml），and then were treated with PGE2 in different concentrations（0.625，1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）for 24 h.The ability of antigen uptake and the expressions of CD40，CD83 and MHC-Ⅱon DCs surface were analyzed by flow cytometry；EP4R expression was also measured by flow cytometry.T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction was analyzed by MTT assay.ResultsPGE2（2.5，5，10 nmol／L）significantly enhanced the expression of CD40，CD83，MHC class II molec-ules.However，PGE2 had no effect on CD80 expression in all of concentrations.PGE2（1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）significantly inhibited the ability of antigen uptake of DCs.DCs stimulated by PGE2（2.5，5，10 nmol／L）could promote T cell proliferation.PGE2（2.5，5，10 nmol／L）increased EP4 expression on DCs surface.ConclusionPGE2 could regulate DCs function，which might be related to EP4 receptor expression affected by PGE2.

EP4R；dendritic cells；PGE2

R 392.12

A

1000－1492（2015）07－0879－06

2015－03－16接收

国家自然科学基金（编号：81330081，31100640，81173075，81473223）；中国博士后科学基金第54批面上资助（编号：2013M540509）

安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药物教育部重点实验室，抗炎免疫药物安徽省协同创新中心，合肥230032

盛康亮，男，硕士研究生；张玲玲，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：llzhang ＠ahmu.edu.cn；魏 伟，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn

*对本文具有同等贡献