自噬抑制剂在内质网应激状态下对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异

李文成，刘加涛，高 爽，于瀚卿，吴 圣，范璐璐，孙国平

自噬抑制剂在内质网应激状态下对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异

李文成，刘加涛，高 爽，于瀚卿，吴 圣，范璐璐，孙国平

目的研究自噬在内质网应激（ERS）状态下对肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异。方法体外常规培养的人肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L-02，分别给予衣霉素（TM）单药和TM联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（TM ＋3-MA）或氯喹（TM＋CQ）作用12、24、48 h后，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力变化，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot法检测自噬蛋白LC3的变化。结果TM可引起HepG2细胞和L-02细胞死亡并呈时间依赖关系，3-MA或CQ均可增加TM对HepG2细胞的生长抑制作用，24 h细胞存活率分别为TM＋3-MA组（60%）、TM＋CQ组（72%）、TM组（86%），差异有统计学意义（P＜0.01）；但对于L-02细胞，其存活率分别为83%、84%、83%，活力没有明显差异；流式细胞术显示TM＋3-MA、TM＋CQ和TM组对HepG2细胞的凋亡率分别为15%、11%、7%，差异有统计学意义（P ＜0.01），但对L-02细胞，凋亡率分别为16%、17%、16%，未见明显差异；Western blot法结果显示TM作用引起两种细胞自噬增加，自噬抑制剂3-MA与CQ可引起两种细胞自噬作用减弱。结论自噬抑制剂（3-MA或CQ）均可显著增加TM对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用，但对正常肝细胞L-02的生长抑制作用差异无统计学意义。自噬在ERS状态下可对肝癌细胞的生存提供保护，但对正常肝细胞无保护作用。

自噬抑制剂；内质网应激；肝癌；肝正常细胞

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）在我国的发病率仅次于肺癌和胃癌，死亡率在所有肿瘤中位居前三位［1］。肝癌细胞对化学治疗药物相对不敏感，有效率≤20%［2］。如何能提高HCC的化疗敏感性已成为当今研究的热点。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞对一系列可以干扰内质网稳态的因素所做出的反应。自噬是细胞对恶劣环境及压力的一种反应，但其对细胞生存的意义并不清楚［3］。该研究旨在观察自噬在ERS状态下对肝癌HepG2细胞及正常肝细胞L-02生存影响的差异，探寻肿瘤特异性治疗的新方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂噻唑蓝（MTT）、衣霉素（tunicamycin，TM）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、氯喹（chloroquine，CQ）、兔抗人微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗体均购自美国Sigma公司；抗β-actin多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Annexin V-FITC细胞双染凋亡试剂购自上海贝博公司。

1.2 主要仪器设备包括Acpo-6100 CO2培养箱（美国杜邦公司）；YJ-1450型医学净化工作台（苏州净化设备公司）；倒置式显微镜（日本Olympus公司）；Elx-800型酶标仪（美国Bio-Tek仪器公司）；EPICS XL／XL-MCL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；ImageQuantTMLAS-4000型发光成像系统（日本通用电气医疗集团生命科学部）。

1.3 细胞系人HepG2肝癌细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库；人L-02细胞购自武汉细胞库。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养液及细胞悬液的制备 人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞L-02分别培养于含10%新生胎牛血清的DMEM和1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，取对数生长期细胞用于实验。

1.4.2 MTT法检测增殖抑制率 取对数生长期的HepG2及L-02细胞，以5.0×103个／孔的细胞密度接种于96孔板中，设实验组（TM＋3-MA组、TM＋CQ、TM组）、细胞对照组和空白组。待细胞贴壁后，分别加入3-MA（5 mmol／L）和CQ（5 μg／ml）预处理细胞1 h，然后每孔加入3 μmol／L的TM，以只加培养液的细胞设为细胞对照组，每组设5个复孔。共同培养12、24、48 h后，每孔加入MTT溶液继续孵育4 h，吸出各孔培养液，再加入DMSO 150 μl，用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度（optical density，OD）值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（OD实验组值－OD空白组值）／（OD对照组值－OD空白组值）×100%。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将未处理及药物处理组的HepG2细胞和L-02细胞终止培养，消化后收集离心、PBS溶液洗涤2次，重混悬于400 μl结合缓冲液中。按照Annexin V-FITC／PI凋亡检测试剂盒说明书分别加入Annexin V和PI染液，立刻进行流式细胞术检测，FlowJo软件进行数据分析。将全部细胞分为4群，Q4：Annexin V-PI-认为是存活细胞；Q3：Annexin V＋PI-认为是早期凋亡细胞；Q2：Annexin V＋PI＋认为是凋亡后继发坏死细胞；Q1：Annexin V-PI＋认为是坏死细胞。计算细胞凋亡率（%）＝（Annexin V＋PI＋细胞数＋Annexin V ＋PI-细胞数）／10 000×100%。

1.4.4 Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达 将未处理及药物处理组的HepG2细胞和L-02细胞终止培养，冷PBS洗3遍，冰上裂解后离心，收集上清液，采用BCA法蛋白定量后，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，取10 μl蛋白进行实验：用12.5%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h，洗膜后，加入一抗置于湿盒中，4℃孵育过夜。次日，洗膜后，加入二抗室温孵育2 h，最后加入电化学发光试剂，采用ImageQuantTMLAS-4000型发光成像系统检测蛋白荧光信号并显像。ImageJ分别测量LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ条带的积分光密度值，以LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ值来反映LC3的转变。

1.5 统计学处理应用SPSS 16.0软件进行分析，数据以±s表示。组间比较采用单因素方差分析和LSD法进行两两比较。图表均在GraphPad Prism 5软件中完成。

2 结果

2.1 3-MA或CQ对两种细胞的增殖抑制率MTT检测结果显示，3-MA或CQ联合TM共同培养HepG2细胞12、24、48 h后，HepG2细胞活力明显下降（F＝41.782、30.215、131.806，P＜0.01），见图1A。3-MA或CQ联合TM共同培养L-02细胞12、24、48 h后，48 h TM＋CQ组与TM组比较，L-02细胞活力明显下降（F48 h＝24.563，P＜0.05），其他组细胞活力差异均无统计学意义（F12 h＝0.898，F24 h＝0.437）。见图1B。自噬对肝癌HepG2细胞可能发挥着保护作用；但对正常肝细胞L-02无保护作用。

2.2 3-MA或CQ对两种细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示，3-MA或CQ联合TM作用HepG2细胞24 h，HepG2细胞凋亡率均显著高于TM组（F＝97.757，P＜0.01）。TM和TM联合3-MA或CQ分别作用于L-02细胞24 h，实验组凋亡率均高于细胞对照组（F＝142.506，P＜0.01），但各实验组间凋亡率差异无统计学意义（F＝0.674，P＞0.05）。见图2。

2.3 自噬相关蛋白LC3的表达水平Western blot法检测显示，HepG2细胞经TM作用24 h后，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ灰度值比值较细胞对照组明显升高，加入自噬抑制剂3-MA或CQ后，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ较TM组下降（F＝168.306，P＜0.01）。L-02细胞亦可见相似的改变（F＝225.420，P＜0.01），见图3。

3 讨论

ERS即未折叠／错误折叠蛋白的积聚。轻度ERS时，内质网可以通过激活未折叠蛋白反应启动自噬［4］，清除那些超出蛋白酶体清除能力的错误折叠蛋白，以恢复内质网稳态，促使细胞存活［5］。而过度或持久ERS时，一方面可通过启动内质网相关性死亡途径［6］促使细胞凋亡；另一方面可通过过度激活内噬致使自噬性细胞死亡（autophagic cell death，ACD）［7］。ERS诱导剂TM抑制蛋白质的N－端的糖基化，从而使不能折叠的蛋白质在内质网内发生大量蓄积，从而引起ERS的发生［8］。TM作用后两种细胞LC3-I向LC3-Ⅱ转化均明显增加，说明ERS状态下自噬是激活的。

ERS可以诱导自噬，为观察ERS状态下使用不同作用机制的自噬抑制剂抑制自噬对于细胞生存的影响，本研究分别选择作用于自噬通路上游激酶Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶，促进早期自噬体成核阶段的3-MA和抑制自噬晚期阶段溶酶体降解的CQ，观察ERS状态下抑制自噬对于细胞增殖、凋亡的影响。与TM组比较，联合自噬抑制剂组的HepG2细胞活力明显下降，凋亡明显增加。但相同条件下，在L-02细胞中加入3-MA，3个时间点均未见L-02细胞活力有明显差异；而TM＋CQ组仅在作用48 h后，显示细胞活力下降，提示在ERS状态下，CQ长时间作用，可导致自噬体不断积聚，但其降解途径受阻，故细胞结构大量破坏，或可导致ACD，从而增加细胞死亡率。推测自噬在ERS状态下可对肝癌细胞提供生存保护，对正常肝细胞L-02的增殖和凋亡无明显影响。研究［3］显示，ERS诱导的自噬作用是清除多泛素化蛋白的聚集和减少在HCT116结肠癌细胞和DU145前列腺癌细胞空泡化，从而减轻ERS和防止细胞死亡。与此相反，相同的化学品诱导的自噬不会为正常的人类结肠细胞提供保护，并在未转化的小鼠胚胎成纤维细胞反而促进细胞死亡。体外研究［9］表明，抑制自噬后，蛋白酶体抑制剂诱导凋亡的效果会在恶性转化的细胞中增加，而在正常细胞中无明显变化。

LC3蛋白是酵母自噬相关蛋白的同源蛋白，理论上自噬时应表现为LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的增加，通过LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ／（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）即可反映自噬水平［10］。本实验显示，两种细胞在分别加入3-MA后，与TM组比较，均观察到相应的LC3-Ⅰ的增加及LC3-Ⅱ的减少，符合3-MA阻断LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变的作用机制，从而抑制自噬的发生。加入CQ后，可见LC3-Ⅱ蛋白明显积聚，通过这种基于自噬性降解的自噬潮分析，可见自噬活性被抑制，同时，也可反映整个自噬过程是通畅的。在L-02细胞中，TM组看不到LC3灰度值上调的现象，但TM ＋CQ组LC3-Ⅱ蛋白的高表达，可推测因细胞自噬活性很强，自噬体降解速度很快，自噬的激活不断消耗胞质内的LC3，所以仅检测出很弱的表达［11］。

综上所述，本研究证实自噬在ERS状态下可对肝癌细胞提供生存保护，而同样的条件下，却未能为正常的肝细胞提供保护作用。这种正常细胞与肿瘤细胞对自噬反应差异的原因仍需进一步研究。如果这种现象得到证实，那么ERS诱导剂和自噬抑制剂的联合使用对于癌症的治疗将会起着重要的作用，或可为肿瘤的特异性治疗提供新的方向。本研究仅限于体外培养的细胞株的观察，进一步的分子机制及体内的效应有待进一步研究。

［1］ Calvisi D F，Frau M，Tomasi M L，et al.Deregulation of signaling pathways in prognostic subtypes of hepatocellular carcinoma：novel insights from interspecies comparison［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1826（1）：215－37.

［2］ Bosetti C，Levi F，Boffetta P，et al.Trends in mortality from hepatocellular carcinoma in Europe，1980－2004［J］.Hepatology，2008，48（1）：137－45.

［3］ Ding W X，Ni H M，Gao W，et al.Differential effects of endoplasmic reticulum stress-induced autophagy on cell survival［J］.J Biol Chem，2007，282（7）：4702－10.

［4］ Guerin R，Arseneauh G，Dumont S，et al.Calnexin is involved in apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in the fission yeast［J］.Mol Biol Cell，2008，19（10）：4404－20.

［5］ Scheper W，Nijholt D A，Hoozemans J J.The unfolded protein response and protestasis in Alzheimer disease：preferential activation of autophagy by endoplasmic reticulum stress［J］.Autophagy，2011，7（8）：910－1.

［6］ Meir O，Dvash E，Werman A，et al.C／EBP-β regulates endoplasmic reticlum stress-triggered cell death in mouse and human models［J］.PLoS One，2010，5（3）：e9616.

［7］ 刘东雷，王建军，杨 洋，等.自噬在顺铂诱导的食管癌细胞死亡中的作用［J］.中华实验外科杂志，2010，27（9）：1198－9.

［8］ Barba-Espin G，Dedvisitsakul P，Hagglund P，et al.Gibberellic acid-induced aleurone layers responding to heat shock or tunicamycin provide insight into the N-glycoproteome，protein sectrtion，and endoplasmic reticulum stress［J］.Plant Physiol，2014，164 （2）：951－65.

［9］ Furuta S，Hidaka E，Ogata A，et al.Ras is involved in the negative control of autophagy through the class I PI3-kinase［J］.Oncogene，2004，23（22）：3898－904.

［10］Kadowki M，Karim M R.Cytosolic LC3 ratio as a quantitative index of macroautophagy［J］.Methods Enzymol，2009，452：199－213.

［11］马 泰，孙国平，李家斌.细胞自噬的研究方法［J］.生物化学与生物物理进展，2012，39（3）：204－9.

The different function of autophagy inhibitors between HepG2 liver cancer cells and normal liver cells L-02 in the endoplasmic reticulum stress state

Li Wencheng，Liu Jiatao，Gao Shuang，et al
（Dept of Medical Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the difference in function of autophagy inhibitors between HepG2 and L-02 cells in the state of endoplasmic reticulum stress.MethodsThe HepG2 cells and L-02 cells were routinely cultured in vitro and treated either with tunicamycin（TM）or combination with the autophagy inhibitors 3-methylade-nine（3-MA）or chloroquine（CQ）.The cell viability was detected by MTT assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.The change of autophagy-related protein LC3 was analysed by Western blot assay.ResultsMTT assay demonstrated that TM could time-dependently induce the death of HepG2 cells and L-02 cells，and the cell viability of HepG2 cells was significantly restrained when it was administrated in combination with 3-MA or CQ，the cell survival rates of 24 h were：3-MA＋TM（60%），CQ＋TM（72%），TM（86%）respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.However，it had no significant effect with L-02 cells because of its cell survival rates of 24 h were：83%，84%and 83%.Flow cytometry apoptosis experiment found that：TM＋3-MA，CQ＋TM and TM group on HepG2 cell apoptosis rates were 15%，11%and 7%respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.But for L-02 cell group，the apoptosis rates were 16%，17%，16% which had no obvious difference.According to the results of Western blot，TM could cause increased autophagy，and autophagy inhibitor CQ could lead to increased autophagy tide.ConclusionThe cell viability of HepG2 cells，not the L-02 cells，can be significantly restrained by TM combined with different autolysosome inhibitor 3-MA or CQ.So the autophagy can protect the hepatocarcinoma cell line HepG2 under the state of endoplasmic reticulum stress，and it can’t provide the same protection to L-02 cell line.

autophagy inhibitors；endoplasmic reticulum stress；liver neoplasms；liver cell

R 735.7

A

1000－1492（2015）07－0884－05

2015－03－17接收

国家自然科学基金（编号：81272739）；安徽省科技攻关项目（编号：12010402122）

安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥 230022

李文成，女，硕士研究生；孙国平，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：sunguoping＠ahmu.edu.cn