青蒿琥酯对高糖诱导的肾小管上皮细胞TLR4、NF-κB表达及合成的影响

蒋姗姗，龙 艳，苏 珂，聂 寒，杨 帆，郑天鹏，莫如芬

青蒿琥酯对高糖诱导的肾小管上皮细胞TLR4、NF-κB表达及合成的影响

蒋姗姗，龙 艳，苏 珂，聂 寒，杨 帆，郑天鹏，莫如芬

目的探讨青蒿琥酯（Art）对高糖诱导下的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-κB（NF-κB）表达及合成的影响。方法体外培养NRK-52E细胞，分为6组：正常对照组、高糖组、Art小剂量组、Art中剂量组、Art高剂量组、依那普利组。培养48 h后收集各组细胞，采用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）法检测细胞TLR4、NF-κB mRNA含量；采用Western blot法检测细胞TLR4、NF-κB蛋白表达水平。结果①与正常对照组比较，高糖组细胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；②与高糖组比较，Art小、中、高剂量组细胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；③与依那普利组比较，Art小、中、高剂量组细胞TLR4水平表达均升高，且Art高剂量组与依那普利组差异无统计学意义。与依那普利组比较，Art小、中剂量组细胞NF-κB水平表达升高，Art高剂量组细胞NF-κB水平表达降低，且Art中、高剂量组与依那普利组差异无统计学意义。结论Art可呈剂量依赖性地抑制高糖环境下NRK-52E细胞TLR4、NF-κB的高表达及合成。

糖尿病肾病；青蒿琥酯；肾小管上皮细胞；Toll样受体4；核转录因子-κB

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）本质上是一种慢性炎症性疾病，炎症反应和促炎症细胞因子在DN的发展中起着决定性作用［1］。Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）是一个主要分布于炎症细胞表面的受体超家族，其中TLR4（Toll-like receptor-4，TLR4）主要分布在肾组织，可通过激活核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）而引起肿瘤坏死因子α、白细胞介素8等前炎症因子的表达增加，诱导炎症反应的发生［2］，同时炎症因子又可进一步激活NF-κB，从而诱发炎症信号不断放大［3］。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我国传统中药青蒿素的一种水溶性衍生物，是治疗疟疾的经典药物［4］，研究［5］显示其对多种炎症性病理模型如佐剂性关节炎大鼠、哮喘大鼠［6］具有明显的抗炎和免疫调节作用，已证实其可减轻肾间质炎性损伤［7］，但Art是否对肾小管上皮细胞TLR4及NF-κB的表达存在影响，目前鲜有文献报道。该实验以大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E为模型，观察高糖及Art对肾小管细胞TLR4、NF-κB水平的影响，为Art应用于DN防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 NRK-52E购自上海复祥生物科技有限公司（源于ATCC，货号CRL-1571）。

1.1.2 主要药物与试剂 注射用Art（桂林南药股份有限公司，批号LA130613）；马来酸依那普利原料药（武汉胜天宇生物科技有限公司）；低糖、高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；PCR引物由Invitrogen（上海）贸易有限公司设计合成；WIP组织细胞裂解液、（北京博奥森生物技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；SDSPAGE凝胶制备试剂盒、PVDF膜（北京索莱宝科技有限公司）；预染蛋白Marker（美国Thermo公司）；兔抗鼠TLR4多克隆抗体（美国Affinity公司）；兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗GAPDH多克隆IgG抗体（杭州贤至生物科技有限公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Super ECL Plus超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.2 细胞培养与分组

1.2.1 细胞培养 NRK-52E用含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml链霉素的低糖DMEM培养基（D-葡萄糖浓度5.6 mmol／L）于37℃、5% CO2无菌培养箱中孵育。细胞呈单层贴壁生长，长至80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3传代培养，每2～3 d传代1次。取第5～10代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组 细胞生长至亚融合状态时加入无血清低糖DMEM培养基，同步化24 h，根据预实验筛选的药物浓度，将NRK-52E细胞分为6组：①正常对照组：低糖DMEM培养基（D-葡萄糖终浓度5.6 mmol／L）；②高糖组：高糖DMEM培养基（D-葡萄糖终浓度25 mmol／L）；③Art小剂量组：高糖DMEM培养基＋Art（终浓度10 mg／L）；④Art中剂量组：高糖DMEM培养基＋Art（终浓度20 mg／L）；⑤Art高剂量组：高糖DMEM培养基＋Art（终浓度30 mg／L）；⑥依那普利组：高糖DMEM培养基＋依那普利（终浓度5 mg／L）。

1.3 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测NRK-52E细胞中TLR4、NF-κB mRNA表达细胞按上述分组加药处理48 h后，提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度后，将总RNA逆转录成cDNA后进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性3 s，退火30 s（各目的引物的引物序列及退火温度见表1），72℃延伸1 min，循环31次，72℃延伸5 min。取PCR产物6 μl，以浓度为1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 mg／L溴化乙啶）电泳，用SensiAnsys凝胶成像系统摄影并定量分析，计算名组目的基因与内参基因光密度值的比值。

表1 RT-PCR引物序列及反应条件

1.4 Western blot法检测NRK-52E细胞中TLR4、NF-κB p65蛋白表达细胞按上述分组加药处理48 h后，提取各组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取30 μg蛋白样品加入上样缓冲液，95℃水煮变性5 min后，进行10%SDS-PAGE凝胶变性电泳，然后转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉摇床室温封闭2 h，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶200）、GAPDH（1∶1 000），摇床4℃孵育过夜。TBST洗膜后加辣根酶标记二抗（1∶5 000），摇床室温孵育2 h，TBST洗膜后加适量发光液暗室发光，曝光后在SensiAnsys凝胶成像系统下拍照并获取灰度值，以相应目的蛋白条带与内参蛋白条带的灰度比值计算名组蛋白的相对表达量。

1.5 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，所有实验均重复3次，数据以±s表示。多个样本之间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 高糖和Art对NRK-52E细胞TLR4、NF-κB mRNA表达的影响RT-PCR结果显示，各组加药处理48 h后，正常对照组细胞中TLR4、NF-κB mRNA的表达呈较低水平，高糖组水平明显升高（P＜0.05）；而Art小、中、高剂量组和依那普利组水平明显低于高糖组，但仍高于正常对照组（FTLR4＝273.475、FNF-κB＝80.641，P＜0.01），且Art中、高剂量组较Art小剂量组下调效应更加显著（P＜0.05）。Art小、中、高剂量组TLR4 mRNA表达水平较依那普利组升高，且Art高剂量组与依那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。Art小、中剂量组NF-κB mRNA表达水平较依那普利组升高，而Art高剂量组的水平较依那普利组降低，且Art中、高剂量组与依那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

表2 各组细胞TLR4、NF-κB mRNA表达（n＝3，±s）

表2 各组细胞TLR4、NF-κB mRNA表达（n＝3，±s）

与正常对照组比较：*P＜0.05；与高糖组比较：＃P＜0.05；与Art小剂量组比较：△P＜0.05；与Art中剂量组比较：▽P＜0.05

组别TLR4／β-actinNF-κB／β-actin正常对照0.096±0.0120.075±0.010高糖0.670±0.024*0.870±0.039*Art小剂量0.451±0.013*＃0.684±0.024*＃Art中剂量0.358±0.045*＃△0.507±0.060*＃△Art高剂量0.183±0.008*＃△▽0.347±0.054*＃△▽依那普利0.166±0.010*＃△▽0.446±0.090*＃△

2.2 高糖和Art对NRK-52E细胞TLR4、NF-κB p65蛋白表达的影响Western blot结果显示，各组加药处理48 h后，与正常对照组比较，高糖组细胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表达明显增高（P＜0.05）；与高糖组比较，Art小、中、高剂量组和依那普利组细胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表达均降低，但仍高于正常对照组（FTLR4＝76.482、FNF-κB＝97.262，P＜0.01），且Art中、高剂量组较Art小剂量组下调效应更加显著（P＜0.05）。Art小、中、高剂量组TLR4蛋白表达水平较依那普利组升高，且Art高剂量组与依那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。Art小、中剂量组NF-κB p65蛋白表达水平较依那普利组升高，而Art高剂量组的水平较依那普利组降低，且Art中、高剂量组与依那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表3。

表3 各组细胞TLR4、NF-κB蛋白表达（n＝3，±s）

表3 各组细胞TLR4、NF-κB蛋白表达（n＝3，±s）

与正常对照组比较：*P＜0.05；与高糖组比较：＃P＜0.05；与Art小剂量组比较：△P＜0.05；与Art中剂量组比较：▽P＜0.05

组别TLR4／GAPDHNF-κB／GAPDH正常对照0.061±0.0130.026±0.005高糖0.816±0.107*0.636±0.060*Art小剂量0.592±0.053*＃0.408±0.045*＃Art中剂量0.414±0.055*＃△0.271±0.024*＃△Art高剂量0.230±0.014*＃△▽0.147±0.013*＃△▽依那普利0.242±0.013*＃△▽0.193±0.047*＃△

3 讨论

DN是一种进行性发展的疾病，高血糖和炎症反应是DN发生、发展的关键因素［8］。目前治疗DN的药物很多都是通过抗炎治疗的，其中血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）是目前在DN治疗中应用时间最长的药物，有很好的肾脏保护作用，其可通过多种机制抑制DN炎症反应，故本研究采用依那普利作为阳性对照药物。

TLR是参与免疫炎症反应、介导慢性炎性疾病的重要因素，其中包括糖尿病及其慢性并发症。TLR4受体是发现最早的TLR亚型之一，在肾脏固有细胞如肾小管上皮细胞、系膜细胞能特异性地识别病原相关分子模式，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号导入细胞内，启动包括髓样分化蛋白88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性及非MyD88依赖性信号转导途径，使转录因子NF-κB活化［9］。NF-κB是体内重要的转录因子，通常以p50和p65组成的异源二聚体的形式存在于细胞内，在多种转录过程中发挥关键作用。在静息状态下，NF-κB二聚体与抑制性蛋白质IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）结合，存在于细胞质内。IκB蛋白受IκB激酶调控，当细胞受到氧化应激或炎性细胞因子等信号刺激时，IκB激酶逐步被激活，导致IκB蛋白发生磷酸化、泛素化和降解，而解离后的NF-κB二聚体则转移到细胞核，结合特定的DNA序列，并激活靶基因的转录［10］。激活的NF-κB能调控多种炎症细胞因子、趋化因子、黏附因子的转录，在免疫炎症反应、细胞生长等方面起重要作用。国内现已有许多研究表明，TLR4／NF-κB信号通路在DN的发生发展过程中起着十分重要的作用。研究［11］显示，DN患者肾组织中TLR4及相关炎性因子的表达显著升高。章超群等［12］的动物实验发现，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型肾组织中TLR信号通路蛋白TLR2、TLR4、MyD88与NF-κB p65表达明显高于正常组。顾俊菲等［13］的体外实验显示，高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞NF-κB表达合成较正常糖组显著增高。本研究结果也显示，高糖诱导后大鼠肾小管细胞中TLR4和NF-κB的表达均升高，与研究［14］结果一致。

Art是经典的抗疟药物，近年来研究［6，15］显示Art可通过下调TLR4和NF-κB的表达来发挥抗炎和免疫调节的作用。本实验结果显示，用不同浓度Art干预高糖培养的大鼠肾小管上皮细胞后，TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的表达水平均较高糖组明显下降，且Art浓度越高，下调作用越明显，呈现出明显剂量依赖性，从一定程度可说明Art可抑制DN的炎症反应。由于本实验只观察了各组细胞加药处理后48 h的变化，是否存在时间依赖性仍需进一步研究。此外，本实验显示Art高剂量组与依那普利组TLR4水平差异无统计学意义，Art中、高剂量组与依那普利组NF-κB水平差异无统计学意义，说明适当剂量的Art在下调TLR4／NF-κB炎性信号通路方面可与ACEI类药物依那普利达到同样的效果。

综上所述，本研究结果显示Art可以降低高糖诱导的NRK-52E细胞中TLR4和NF-κB表达，该作用可能与肾脏保护有关，但Art作用于TLR4／NF-κB炎性信号通路的具体机制尚不明确，有待进一步研究。

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Effects of artesunate on expression and synthesis of Toll-like receptor 4 and nuclear factor-κB in renal tubular epithelial cells induced by high glucose

Jiang Shanshan，Long Yan，Su Ke，et al
（Dept of Endocrinology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo explore the effects of artesunate（Art）on expression and synthesis of Toll-like receptor-4（TLR4）and nuclear factor-κB（NF-κB）in rat renal tubular epithelial cells（NRK-52E）induced by high glucose.MethodsNRK-52E cells were cultured and divided into six groups：normal control group，high glucose group，Art in low dose group，Art in medium dose group，Art in high dose group，and Enalapril group.Cells were collected after 48 hours.The expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels were detected by RTPCR and Western blot.Results①Compared with the normal control group，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in high glucose group gradually increased（P＜0.05）；②Compared with the high glucosegroup，as increases in Art doses，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups gradually reduced（P＜0.05）；③Compared with the Enalapril group，the expressions of TLR4 mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups increased，and the difference between the Art in high dose group and the Enalapril group had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the Enalapril group，the expressions of NF-κB mRNA and protein in the Art in low and medium dose groups increased，but decreased in the Art in high dose group.Furthermore，there was no statistical difference in the Art in medium and high dose groups when compared with the Enalapril group（P＞0.05）.ConclusionArt can suppress the high expression and synthesis of TLR4 and NF-κB of NRK-52E cells induced by high glucose in a dose-dependent manner.

diabetic nephropathy；artesunate；renal tubular epithelial cells；toll-like receptor-4；nuclear factor-κB

R 587.1；R 692.6

A

1000－1492（2015）07－0904－05

2015－03－20接收

广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目（编号：S201316-07）；广西自然科学基金项目（编号：2012GXNSFAA053085）；广西高等学校计划科研项目（编号：201204LX245）

桂林医学院附属医院内分泌科，桂林 541004

蒋姗姗，女，硕士研究生；龙 艳，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：ly136988＠163.com