杨凌某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

张 瑜，高晶晖，张立强，高 洋，贾云晓，陈德坤

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

羊口疮（Orf）又叫羊接触传染性脓疱皮炎（Contagious pustular dermatitis），是由羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种接触性传染病。病毒主要感染绵羊和山羊，山羊比绵羊易感，羔羊比青年羊更易感，羊感染后口唇部产生增生性损伤［1］。3月龄～6月龄的羔羊发病率一般为95.4%左右，致死率一般在0～93%之间［2］。羊口疮在世界各养羊国家中分布较为广泛，对养羊业造成较大的威胁［3］。在我国青海、宁夏、新疆、陕西、吉林、四川、黑龙江、西藏和甘肃等地都有羊口疮流行的相关报道，给养羊业造成了较大的损失［4－6］。文献报道［7］，近年来羊口疮病毒分离株出现了基因变异，这些变异是否会导致我国羊口疮弱毒疫苗免疫保护效果下降，还存在一些争议。因此，有必要对我国各地羊口疮野毒株进行分离和基因分析，以便为羊口疮防控策略和具体措施制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 具有典型羊口疮临床症状的山羊，来自杨凌某养殖场。

1.1.2 犊牛睾丸 采自1日龄犊牛。

1.1.3 主要试剂 M199培养基为Gibco公司产品；胎牛血清、胰酶、二甲基亚砜均为Amresco公司产品；乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、葡萄糖、琼脂糖等为国产或进口分析纯；PCR相关试剂为TaKaRa公司产品。

1.1.4 主要仪器 CO2培养箱，高压蒸汽灭菌器，各量程移液器，离心机，电子分析天平，冰箱，恒温循环水浴锅，－70℃冰箱，超净工作台，倒置显微镜，PCR仪，电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 病料采集与处理 采集患病羔羊口唇部结痂，置5mL离心管中，加入10g／L青、链霉素的PBS液3mL，4℃放置过夜。用组织匀浆器将病料充分研磨，2 000r／min离心10min，取上清用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，置－20℃保存备用。

1.2.2 犊牛睾丸原代细胞的制备 将犊牛睾丸用750mL／L的酒精消毒，剪去筋膜组织，PBS冲洗睾丸实质组织。将组织剪成小块，加入2.5g／L胰酶于4℃放置14h后，用PBS液洗涤多次，直至胰酶冲洗干净，加入无血清M199培养基反复吹打组织至细胞完全散开。将犊牛睾丸细胞悬液移入细胞培养瓶，37℃、体积分数为5%CO2条件下培养。

1.2.3 病毒增殖 待培养的犊牛睾丸原代细胞铺满瓶底约80%时，弃培养基，接种500μL痂毒滤液，在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中作用1h。再加入含50mL／L犊牛血清的M199培养基10mL，37℃、体积分数为5%CO2条件下继续培养。前4代未观察到明显的病变（CPE），接毒72h后反复冻融细胞3次，收集病毒液，盲传至第5代犊牛睾丸原代细胞出现明显CPE，当70%～80%的细胞发生病变、脱落时，将培养细胞反复冻融3次，收集病毒液。

1.2.4 病毒滴度测定 收集第5代细胞毒。参照本实验室建立的方法［8］测定病毒滴度。主要操作程序如下，用96孔细胞培养板培养犊牛睾丸原代细胞72h后，接种10倍稀释的病毒液，从10－1～10－10每个稀释度接种一列，每孔接种100μL，第11和12列作为细胞空白对照。然后置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，连续7d观察发生细胞病变的孔数。根据Reed－Muench氏法计算病毒的TCID50。

1.2.5 B2L、F1L基因的PCR检测 用氯仿－异戊醇方法提取第5代病毒液的DNA，参照本实验室建立的羊口疮病毒B2L、F1L基因PCR检测方法［9］进行检测。B2L、F1L引物分别参照登录号为JN565696.1和HQ221964.1的羊口疮病毒基因序列设计。PCR反应体系为：dNTP 2μL，Ex Taq buffer 2.5μL，MgCl22μL，Ex Taq 0.25μL，模板（Template）2μL，引物（Primer）各1μL，ddH2O 18.25μL。PCR 反应程序为：95℃ 5min；94℃45s，56℃30s，72℃70s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，用含15g／L的琼脂糖凝胶进行电泳检测。将PCR产物送往南京金斯瑞公司进行测序，测序结果与参照序列进行比对，以确定扩增的片段是否为羊口疮病毒的基因片段。

2 结果

2.1 发病羊的临床症状

此羊场发病羊为30日龄～45日龄，临床可见病羊口唇部周围产生红斑，伴有轻微肿胀。在感染3d～5d内产生水疱和脓疱，严重者脓疱破裂后暴露出出血创面。溃烂的脓疱最终融合形成灰色痂皮（图1）。由于口唇部的病变，引起羔羊采食和吮乳困难，羔羊严重消瘦，有的羔羊发生继发感染。

图1 羊口疮发病羊照片Fig.1 Photoes of lamb infected with Orf virus

2.2 分离病毒引起的细胞病变观察

研磨液接种至犊牛睾丸原代细胞，盲传至第5代时，接种的细胞产生明显病变。病变细胞出现折光性增强、变圆、聚堆等现象，后期细胞发生皱缩、脱落，CPE达90%（图2），而正常对照的犊牛睾丸原代细胞生长状态良好（图3）。

图2 接毒72h后发生细胞病变的犊牛睾丸原代细胞（20×）Fig.2 Cytopathic effects in calf testis primary cells 72hafter inoculation（20×）

图3 正常犊牛睾丸原代细胞（20×）Fig.3 Normal calf testis primary cells（20×）

2.3 第5代病毒滴度测定

取引起细胞病变的第5代病毒液100μL进行倍比稀释，将不同稀释度的羊口疮病毒液接种到犊牛睾丸原代细胞上，测定其 TCID50。按 Reed－Muench氏法，测得第5代病毒液滴度为107.66TCID50／mL（表1）。

2.4 分离毒株的PCR检测

分别用羊口疮病毒B2L基因和F1L基因的特异性引物扩增到540bp和437bp的基因片段，与预期扩增片段大小一致（图4和图5），将PCR扩增产物测序，测序结果用DNA Man进行比对，B2L基因片段与参比序列JN565696.1的基因序列的相似度为96.57%，F1L的扩增片段与参比序列HQ221964.1的基因序列的相似度为96.43%（图6和图7），确定分离到羊口疮病毒。

表1 第5代病毒TCID50的测定Table 1 TCID50determination of 5th generation virus

图4 B2L基因PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoretic map of B2Lgene PCR products

3 讨论

图5 F1L基因PCR产物电泳图Fig.5 Electrophoretic map of F1Lgene PCR products

近年来，由于各地之间频繁引种及羊只交易，羊口疮在全国各地传播，给我国的养羊业造成了较为巨大的经济损失［10］。已有报道表明，不同羊口疮病毒分离株之间存在不同程度的基因差异［11］。为了获得大量的野毒株样本，本研究通过病毒分离、PCR检测和病毒滴度测定，获得了杨凌羊口疮病毒野毒株。何水林等［12］的研究表明，羊口疮病毒在犊牛睾丸原代细胞上连续传3代时，细胞病变（CPE）稳定出现在48h左右，詹述宣等［13］研究发现，羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞上初代培养3d后即能见到明显的CPE。本研究所分离的羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞上盲传至第5代才出现明显的CPE，其所表现的细胞变圆，折光性增强等细胞病变效应与其他研究者的结果是一致的。出现这样的结果可能与各分离株的强弱、接毒剂量和接毒方式存在一定的关系。

在测定病毒TCID50时，需要连续数日观察病变孔数，对病变孔的判定存在主观差异，需要多次测定最终确定病毒滴度。已有研究采用实时荧光定量PCR的方法测定病毒滴度，与传统方法相比较相关性较高，在后续的试验中可以采用此方法测定病毒滴度［14］。

B2L基因和F1L基因都编码羊口疮病毒表面囊膜蛋白，其中B2L基因的产物可刺激机体产生抗羊口疮病毒的抗体［15］，F1L的产物能促使产生中和抗体［16］。两者均为羊口疮病毒的保守性基因，常被用作羊口疮病毒分子生物学诊断对象，因此本研究应用PCR技术检测羊口疮病毒的这两个基因能够保证检测结果的可靠性。B2L基因片段与设计引物的陕西株基因相似度为96.57%，而与福建株、广西株、四川株等的相似度为99%。F1L基因片段与设计引物的陕西株相似度为96.43%，与甘肃株、新疆株的相似性为99%［17］。这表明不同的羊口疮病毒的B2L和F1L基因高度保守，可分析其他毒力基因以深入研究各毒株的差异。

图6 B2L基因测序及比对结果Fig.6 The B2Lgene sequencing result and sequence alignment results

图7 F1L基因测序及比对结果Fig.7 The F1Lgene sequencing result and sequence alignment results

［1］Nandi S，De U K，Chowdhury S.Current status of contagious ecthyma or orf disease in goat and sheep－A global perspective［J］.Small Ruminant Res，2011，96：73－82.

［2］范春玲，孙 斌，政 伟.羊传染性脓疱病的病理组织学观察［J］.畜牧兽医科技信息，2007（8）：32－33.

［3］李慧霞，朱学亮，骆学农.羊口疮病的研究进展［J］.中国预防兽医学报，2013，35（5）：426－430.

［4］颜新敏，张 强.羊口疮病毒的研究进展［J］.中国动物检疫，2008，25（11）：51－53.

［5］史宗勇，史新涛，古少鹏，等.羊传染性脓疱研究进展［J］.养殖与饲料，2010（11）：35－37.

［6］吴维忠.羊传染性脓疱［J］.青海畜牧兽医杂志，1990（5）：35－37.

［7］Bora D P，Barman N N，Das S K，et al.Identification and phylogenetic analysis of orf viruses isolated from outbreaks in goats of Assam，a northeastern state of India［J］.Virus Gen，2012（45）；98－104.

［8］田婷婷，李 杰，姚运亮，等.羊口疮病毒灭活疫苗的制备及免疫效果观察［J］.动物医学进展，2013，34（6）：17－20.

［9］李前瑞，李 杰，田婷婷，等.羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立［J］.动物医学进展，2013，34（6）：36－38.

［10］张克山，何继军，尚佑军，等.羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析［J］.畜牧兽医学报，2010，41（9）：1154－1157.

［11］苏高莉，赵 魁，孙秀萍，等.羊口疮病毒农安分离株的分离鉴定及Orf059（F1L）基因的序列分析［J］.中国兽医学报，2013，33（1）：4－8.

［12］何水林，陈 杰.羊口疮病毒的分离与鉴定［J］.中国兽医科技，2002，32（9）：22－23.

［13］詹述宣，薛双虎，薛掌林，等.犊牛睾丸细胞培养羊传染性脓疱皮炎病毒的研究［J］.中国兽医科技，1983，13（7）：5－7.

［14］Bora D P，Bhanuprakash V，Venkatesan G，et al.Quantitative polymerase chain reaction：another tool to evaluate viable virus content in live attenuated orf vaccine［J］.Vet Italiana，2012（48）：425－430.

［15］Schmidt C，Cargnelutti J F，Brum M，et al.Partial sequence analysis of B2Lgene of Brazilian orf viruses from sheep and goats［J］.Vet Microbiol，2013（162）：245－253.

［16］Su G，Zhao K，Sun X P，et al.Identification of an Orf virus isolated from sheep herd in Nongan district and sequence analysis of Orf059（F1L）gene［J］.Chinese J Vet Sci，2013（1）：3.

［17］张 瑜.羊口疮病毒杨凌与泸西野毒株的分离鉴定及毒力致弱研究［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2014.