高效液相色谱法测定醒酒护肝口服液中槲皮素含量＊

李庆德，郑锦坤，李旭桂 ，黄红雯 ，张 毅，卞益民，罗启年

(1.广东省粤北人民医院，广东 韶关 512000;2.广东省韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512000;3.丽珠集团利民制药厂药物研究所，广东 韶关 512000)

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪。醒酒护肝口服液(粤北人民医院，批号为 20130301，20130302，20130303);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100081－200907);甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司);纯化水;磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2－3]及系统适用性试验

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.4% 磷酸溶液(50∶50);流速:1.0 mL/min;检测波长:360 nm;柱温:25℃;进样量:10 μL。理论板数按槲皮素峰计算应不低于8 000。取阴性对照品溶液、对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进样，在拟订色谱条件下，主峰的理论板数8 000，与其他杂质峰的分离度 R=2.3，表明系统适用性良好，且阴性对照品溶液在槲皮素吸收峰处无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备[4]

称取槲皮素对照品10.98 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液;精密吸取贮备液3.0 mL，置20 mL容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取醒酒护肝口服液5 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例称取除枳子外其余4味药材，按工艺提取制得的阴性样品，精密量取5 mL，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取对照品贮备液 1，2，3，4，5 mL，分别置20 mL容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=3.810 67×104X －10 762.7，r=0.999 5(n=5)。结果表明，槲皮素进样量在 0.109 8 ～0.549 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取同一对照品溶液，精密量取5 mL，取6份，由3人在不同时间、同一台仪器依法测定槲皮素含量。结果的 RSD=0.40%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，精密量取5 mL，分别于0，2，4，6，8，10 h 时进样测定含量。结果的 RSD=0.20%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

重复性试验:取已知含量的同一批样品，精密量取5 mL，取6份，依法检测。结果含量的 RSD=0.50%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密吸取已知含量的样品(批号为20130301)9份，置20 mL容量瓶中，每份4 mL，分别精密加入槲皮素对照品溶液(每 1 mL 含槲皮素 32.94 μg)2，4，6 mL，各 3 份，混匀，依法测定。结果见表1。

表1 槲皮素加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取3批样品(批号为130301，130302，130303)溶液和对照品溶液，按拟订色谱条件用外标法测定其槲皮素的含量。结果3批样品含量分别为 40.24，46.20，40.64 μg/mL。

3 讨论

供试品溶液的制备:曾考虑先用醋酸乙酯提取，但操作烦琐，且槲皮素流失量大，故选用水直接稀释进样，既能减少槲皮素的损失，又能省时、省试剂，减少环境污染。

检测波长的选择:取槲皮素对照品溶液，于280～450 nm波长范围进行扫描，结果槲皮素于360 nm波长处有最大吸收，故检测波长为360 nm。

流动相的选择:流动相用甲醇－0.4%磷酸(55∶45)和乙腈－0.5%磷酸溶液(33∶67)，均达不到理想的分离效果;以甲醇－0.4%(50∶50)为流动相时，主峰与其他杂质分离度和峰形都理想，故选择该流动相。

含量限定的测定:3批样品平均含量为42.36 μg/mL，且批次间含量差距不大，由于无法考察更多批次枳子的槲皮素含量，因此含量限度的制订结合将来的覆盖面，槲皮素的相对含量较低，检测允许一定的误差范围等因素，根据实测结果，且参照中药的有关资料，含量幅度相对较宽，将含量限度定为每1 mL含槲皮素(C15H10O7)不得少于 30 μg。

[1]李庆德，郑锦坤，赖水招，等.醒酒护肝口服液对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].中国药业，2014，23(3):14 －15.

[2]宋粉云，张德志，钟兆健，等.HPLC法测定枳子中槲皮素的含量[J].中国新药与临床药理，2006，9(17):361－363.

[3]孙学惠，杨文业，韩 冰，等.枳子的提取工艺及含量测定[J].中国药师，2011，14(3):385－387.

[4]曾 嵘，文 为，张 洪，等.高效液相色谱法测定枳子中槲皮素的含量[J].医药导报，2006，25(8):833 －834.