反相高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度方法改进

覃兴昆，程道海

(广西医科大学第一附属医院药学部，广西 南宁 530021)

万古霉素的安全治疗范围较窄，且具有耳、肾毒性，故临床应用时需要监测血药浓度，其有效范围为峰浓度25～40 mg/L、谷浓度5～10 mg/L[1]。采用内标法测定万古霉素血药浓度[2－4]，条件苛刻;血浆处理过程烦琐[5]，或使用如三氯甲烷、二氯甲烷等有害有机溶剂[6－7];流动相采用乙腈 － 缓冲盐系统[2，8－9]，成本高且毒性大。笔者采用外标法，并对血浆中万古霉素的提取过程等条件进行了改进，操作简单，结果准确。现报道如下。

1 仪器与试药

LC－10ATVP型高效液相色谱仪(日本岛津);DF110型电子分析天平(江苏常熟衡器厂);PHS－3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);XW－80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂);TDX FLX75003530/02型高速离心机(美国雅培公司);TF－50型溶剂过滤器(天津市津腾实验设备有限公司);SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);SB2200型超声仪(上海Branson公司)。万古霉素对照品(中国药品生物制品检定所，批号130360－200301，含量为100%);人新鲜血浆(广西南宁市中心血站);甲醇(色谱级，国药集团化学试剂公司)，磷酸二氢钾、磷酸、硫酸锌均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS－2 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo公司);流动相:25 mmol/L磷酸二氢钾(用磷酸调pH至3.2)－ 甲醇(83 ∶17);柱温:25 ℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:230 nm;进样体积:20 μL。

2.2 溶液制备

精密称取万古霉素对照品0.101 2 g，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为2 024 mg/L的万古霉素对照品贮备液。称取硫酸锌30.0 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配制成30%硫酸锌溶液，作为沉淀剂。所有配制成的溶液置4℃冰箱保存备用。

2.3 血样处理

取血浆 450 μL，置 1.5 mL Eppendorf管中，加入沉淀剂 50 μL，涡旋混匀1 min，置50℃水浴锅中加热10 min，取出，10 900 r/min离心5 min，取上清液进样。

2.4 方法学考察

专属性考察:取万古霉素对照品贮备液，用蒸馏水稀释成质量浓度为5 mg/L的对照品溶液，直接进样;另取空白血浆、空白血浆+万古霉素对照品，按2.3项下方法操作。结果万古霉素峰形较好，血浆中内源性杂质对万古霉素测定无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察:取万古霉素对照品贮备液，用空白血浆稀释成质量浓度为 1，2，5，10，20，40，60，80，100 mg/L 的对照品溶液，按2.3项下方法操作，取20 μL进样测定，以质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程 Y=2×10－5X+0.381 5(r=0.999 6)。结果表明，万古霉素质量浓度在1～100 mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系。定量下限为1 mg/L，按信噪比法得检测限(LOD)为 0.2 mg/L。

回收率试验:取万古霉素对照品贮备液，用空白血浆稀释成质量浓度为 5，20，60 mg/L的对照品血浆各 5份，取 450 μL，按2.3项下方法操作，依法测定，结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 万古霉素加样回收试验结果(n=15)

精密度试验:取回收率试验项下低、中、高3种质量浓度含药血样各1份，1 d内连续进样5次以及连续3 d内进样。按峰面积计算，日内 RSD 分别为 3.61%，3.52%，2.93%(n=15)，日间RSD分别为 5.34% ，4.28%，4.06%(n=15)，表明仪器精密度良好。

3 讨论

检测方法改进:因内标法易受干扰，实验条件不易控制。本试验采用外标法测定提取过程简单、无杂质干扰。

检测条件优化:1)血浆处理，结合相关文献RP－HPLC测万古霉素血药浓度的血浆处理方法有固相萃取法[5，10]、液－液萃取法[7，11]、高氯酸沉淀法[12]、三氯醋酸沉淀法[13]、硫酸锌沉淀法[2－3，8]等，其中以硫酸锌沉淀法更简便、安全，但沉淀蛋白的效果与试验时沉淀剂的浓度、用量以及操作时环境的温度有关。最终确定血浆经30%硫酸锌(450 μL血浆中只需加入沉淀剂50 μL)50℃水浴中加热10 min，沉淀剂用量少可大大提高检测的灵敏度。2)流动相，采用25 mmol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.2)－甲醇(83∶17)为流动相，万古霉素峰形较好，并无袁孔现等[3]报道的拖尾现象，血浆中内源性杂质对万古霉素测定无干扰，流动相中缓冲盐浓度较低，对色谱柱的损害较小。甲醇替代了乙腈，毒性和成本均降低，更适合在治疗药物监测中推广应用。3)检测波长选择，多数采用236 nm，少数采用230 nm[4]和210 nm[14]，但发现万古霉素的吸收度于230 nm处大于另外2个波长处，故采用230 nm作为检测波长。

本试验提取方法简单灵敏，峰形好，无内源性杂质干扰，回收率高(＞90%)，精密度好(＜6%)，线性范围宽(1 ～100 mg/L)，适用于基层医院的治疗药物血药浓度监测。

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