鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法的建立

董兵　余裕强　李显赫　李智鹏　宫鹏涛　李建华　张西臣

摘 要：为了建立鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法并进行验证，根据人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段设计巢式PCR特异性引物，对两轮PCR反应的退火温度和反应体系中Mg2+浓度进行探索和优化，在此基础上，进一步通过灵敏性和特异性的检测。采用建立的巢式PCR检测方法对68份鹿粪便样品进行检测。结果表明，建立的巢式PCR方法，第一轮PCR最适退火温度为53 ℃，第二轮PCR最适退火温度为53 ℃；镁离子浓度为2.5 mmol·L-1。对鹿人五毛滴虫的检测精度可达每毫升10个虫体DNA；对犬贾第虫、阴道毛滴虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球虫、大肠杆菌、旋毛虫基因组DNA的扩增的结果均为阴性；68份鹿粪便样品鹿人五毛滴虫的检出率为50%。由此可见，建立的巢式PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可用于鹿人五毛滴虫感染的临床检测。

关键词：鹿；肠道毛滴虫；巢式PCR

中图分类号：S852.72 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.002

毛滴虫是一种有鞭毛的单细胞真核生物，其滋养体经而分裂增殖，主要寄生在泌尿生殖系统以及胃肠道，宿主范围广泛[1]。目前，常见的毛滴虫有人五毛滴虫（Pentatrichomonas hominis）、阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）、口腔毛滴虫（Trichomonas tenax）、胚胎三毛滴虫（Trichomonas foetus）、鸟毛滴虫（Trichomonas gallinae）、猪三毛滴虫（Tritrichomonas suis）、巴特里四毛滴虫（Tetratrichomonas buttreyi）等，其中人五毛滴虫被认为是寄生在哺乳动物肠道内的一类共生类寄生虫[2]，近几年，在我国河南、湖北、广东、安徽等地均有关于人感染人五毛滴虫的临床病例报道[3-8]，而在犬、猫、非灵长类和啮齿类动物的粪便样品中，也检测到了人五毛滴虫的感染 [9-11]。由于尚未有关于鹿感染人五毛滴虫的报道，因而构建一个快速有效的检测方法来评估鹿感染人五毛滴虫的感染情况显得十分必要。

人五毛滴虫主要通过污染饮用水或者食物而被动物或者人误食而感染，在传播过程中苍蝇等也发挥着一定作用，其感染后主要症状表现为腹泻[12]。诊断肠道毛滴虫的主要方法包括直接涂片镜检法、虫体培养法、染色镜检法、普通PCR 检测法、巢氏PCR检测法、原位杂交检测法等[13]，其中直接涂片镜检法、虫体培养法、普通PCR 检测法和染色镜检法精确度不高，原位杂交检测法实验条件要求高且步骤复杂，而巢式PCR检测法常被视为一种快速、便捷、有效的检测方法。本试验通过18S rRNA基因设计了特异性的巢式PCR引物，对镁离子浓度及退火温度进行了优化，并进一步进行了特异性和灵敏性验证，成功构建了鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法。采用构建的巢式PCR检测方法对长春地区68份鹿粪便样品进行了检测，以期为临床检测鹿人五毛滴虫的感染提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因组DNA

试验中涉及的人五毛滴虫、柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、贾第虫均来自于吉林大学寄生虫实验室保存或者培养的，分别提取对应的基因组DNA并保存在-20 ℃冰箱中。试验中用于临床检测的68份鹿粪便样品，均来自于吉林省长春市某养殖场，分别提取对应的基因组DNA并保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP，MgCl2等用于PCR反应的试剂均购自TaKaRa公司（日本）；DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司（日本）；琼脂糖购自法国Biowest公司。

1.3 引物设计与合成

从Genbank中查找到人五毛滴虫18S rRNA基因序列（AY758392），根据此特异性序列，采用Primer Premier 5软件设计内外两套特意性的巢式PCR引物，外侧引物： F1为5′- AGACACGGAGGCGAAGG-3′，R1为5′- AGCCCAGAGCATCTAA AGGA-3′；内侧引物：F2为5′- AGTTCTTGGGCTC TGGG-3′，R2为5′- CCTCTTCCGCCTGCTA -3′。经两轮PCR反应后，扩增的目的片段为大小为322bp的特异性序列。PCR反应中使用的引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 反应体系中Mg2+浓度的优化

以人五毛滴虫基因组DNA作为模板，F1/ R1引物对作为引物进行PCR反应， MgCl2 0.5～5.5 mmol·L-1，5 μL dNTPs，0.5 μL rTaq酶，引物F1和 R1各1 μL，以双蒸水补足体积至50 μL。退火温度为53 ℃，延伸时间为35 s。在PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，对比目的条带的亮度。

1.5 退火温度的优化

分别对巢式PCR的两轮PCR反应的退火温度进行优化，第1轮PCR反应（引物对为F1/ R1）以人五毛滴虫基因组DNA作为模板，MgCl2的终浓度为2.5 mmol·L-1，其他试剂加入量参照上述PCR反应。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性3 min，退火（50，53，55，58 ℃）1 min，72 ℃延伸35 s，循环30次； 72 ℃延伸10 min。

第2轮PCR反应，取1 μL第一轮PCR反应的产物作为模板，以内侧引物对F2/R2作为此次PCR反应的引物，反应体系参照第一轮PCR反应，退火温度设置4个梯度，分别是50，53，55，58 ℃。在PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，并送吉林省库美生物科技有限公司进行测序分析。

1.6 方法的验证

1.6.1 灵敏度测试 取人五毛滴虫，计数，分别将其稀释成1，1 × 101，1 × 102，1 × 103，1 × 104，1 × 105个·mL-1，提取对应的基因组DNA，采用构建好的巢式PCR检测方法进行检测，测试其灵敏度。

1.6.2 特异性验证 以人五毛滴虫基因组DNA作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照，采用已经构建好的巢式PCR反应对柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、贾第虫、犬心丝虫的虫体基因组进行检测，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 样品的检测

以人五毛滴虫基因组DNA作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照，采用已构建好的巢式PCR方法对采集到的68份鹿粪便临床样品进行检测，并送吉林省库美生物科技有限公司进行测序分析，将测序结果在GenBank中进行序列的比对分析。

2 结果与分析

2.1 反应体系中最佳Mg2+浓度

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，由电泳图可知，巢式PCR反应在MgCl2浓度为0.5～5.5 mmol·L-1区间均能扩增出较好的条带，不同MgCl2浓度其对应的PCR产物亮度有差异，当Mg2+浓度为2.5 mmol·L-1时，扩增出的目的片段最亮，见图1。因此选择2.5 mmol·L-1作为巢式PCR反应的最佳Mg2+浓度。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.2 最佳退火温度

为了摸索适合于本巢式PCR反应的退火温度，本试验设计了50，53，55，58 ℃这4个温度梯度，以期探索出退火温度对巢式PCR反应的影响。琼脂糖凝胶电泳分析显示，第一轮和第二轮PCR反应50，53，55，58 ℃这4个退火温度均能扩增出目的片段，且第一轮PCR反应和第二轮PCR反应均在53 ℃退火温度条件下扩增出较为明亮的PCR产物，见图2。将测序结果经拼接后，BLAST比对，结果显示其均为人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段。将PCR反应重复操作两次，电泳结果相一致，故可选择53℃作为两轮PCR反应的退火温度。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.3 方法的验证结果

2.3.1 灵敏度 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，当虫体浓度为10个·mL-1及以上时，可见明亮的条带即PCR反应扩增出了目的条带。将PCR反应重复操作两次，电泳结果相一致，表明本试验构建的巢式PCR检测方法可检测的最低虫体量为10个·mL-1。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.3.2 特异性 将已完成了两轮PCR反应的8个样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。由图可知，只有模板为人五毛滴虫基因组DNA的样品才扩增出目的条带，以其他虫体基因组DNA为模板的样品未扩增出目的条带。由此表明构建的巢式PCR检测方法具有较强的特异性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.4 样品检测结果

分别对68份鹿粪便临床样品进行基因组提取，然后采用此巢式PCR反应进行检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示，34份样品的PCR产物出现目的条带，通过对扩增出的目的片段进行测序、比对，证明其均为人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段，鹿粪样品人五毛滴虫的检出率为50%。

3 讨 论

随着分子生物学技术的发展，其越来越广泛的运用于对毛滴虫的分类鉴定中，Gookin等[14]采用18S rRNA基因、ITS1， 5.8S rRNA， ITS2基因以及部分28S rRNA基因作为靶基因对毛滴虫进行了分子分类鉴定，通过对基因序列的比对确定了其所观察到的毛滴虫为人五毛滴虫。

核糖体RNA也就是rRNA是细胞内含量最多的一类RNA，其与蛋白质组合而成的核糖体参与了细胞内肽链的合成。对于真核生物，rRNA根据沉降系数可将其分为四类，即5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。由于18S rRNA含量较高，长度适宜，大约在1 900 bp，且其存在核糖体蛋白质复合物中[15]，能够为18S rRNA提供一个隔绝RNA酶和其他外界不利因素影响的安全环境，使18S rRNA能够保持很强的稳定性[16]。因此，18S rRNA常被用来对寄生虫进行种属鉴定、遗传多样性分析、系统发育与进化研究、分子分类乃至于抗药性等研究 [17-18]。

目前，对于毛滴虫最常用的检测方法是PCR技术。但是，普通的PCR技术的灵敏度不是很高，且容易出现假阳性。巢氏PCR通过使用内外两套引物对特异性基因进行不同大小片段的两次扩增，只需要极少量的模板，即可扩增出理想的PCR产物极大的提高了检测的灵敏度，并保证了检测结果的特异性[19]。

本试验通过选取人五毛滴虫18S rRNA基因片段，建立了鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法，在对巢式PCR反应中涉及到的退火温度、Mg2+浓度进行了优化后，此检测方法表现出了较高的灵敏度和特异性。通过对临床样品的检测结果的分析，证明了检测的巢式PCR检测方法可以用来对鹿人五毛滴虫的临床检测。同时，通过对鹿的粪便样品的检测，说明了人五毛滴虫可以感染鹿且具有较高的感染率，人五毛滴虫可能会由鹿传播给人，存在着人兽共患的风险。

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