龙山卷丹百合黄瓜花叶病毒的检测

王成龙　源朝政　陈海霞　蒋辉

摘 要：以龙山卷丹百合的病叶为试材，采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合黄瓜花叶病毒的检测，检出率为75%；提取总RNA为模板，通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因大小为514 bp，和预期条带大小一致。经Blast比对发现，该基因片段与Genbank上发表的CMV CP基因序列同源性达96.7%。

关键词：卷丹百合；RT-PCR；DAS-ELISA；百合黄瓜花叶病毒

中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.004

百合聚观赏、食用和药用于一体，有重要的经济价值。卷丹百合在湖南栽培历史悠久，是湖南龙山重要的农产品之一。

百合病毒病是继真菌性病害之后的又一重要病害，发病率高达40%以上，在一定程度上限制了我国百合的生产，并造成巨大经济损失[1-2]。据统计，已报道的百合病毒病有10多种，其中对百合生产危害较大的有3种：百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）发生最为普遍，百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）主要侵染叶片和花部，表现为斑驳，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） 一般为潜隐侵染，常与百合无症病毒复合侵染 [3-6]。黄瓜花叶病毒侵染后主要表现为叶片扭曲，叶面和叶脉有黄斑，花有褐色斑点，且植株矮化，如与百合无症病毒复合侵染，则产生褪绿坏死斑症状，目前在多地东方百合栽培品种中已检测出CMV，并得到病毒分离物[7-11]，但关于湖南龙山卷丹百合感染CMV的报道尚少。为了建立适用于生产实际的百合CMV检测技术，本研究首先采集龙山卷丹百合基地的病样，再结合酶联免疫法和RT-PCR法的检测结果进行鉴定，旨在探索建立湖南龙山卷丹百合病毒检测的技术体系。

1 材料和方法

1.1 DAS ELISA检测法

1.1.1 材料及主要试剂 检测样品：卷丹百合病株样品采自湖南省湘西州龙山县百合产区，田间感病株呈现植株矮缩束顶、部分叶片皱缩、斑驳、条斑和叶脉黄化等生长受阻的症状。

阳性对照：即含CMV病毒的样品，购自上海卡奴生物科技有限公司。

阴性对照：不含CMV病毒的样品，购自上海卡奴生物科技有限公司。

将0.5 g新鲜百合病叶置于预先加入液氮研钵中充分研磨，再转移到装有200 μL裂解液的1.5 mL离心管中，匀浆；4 ℃，15 000 g，离心5 min，弃沉淀，20 ℃保存上清。病毒检测方法参照CMV DAS-ELISA试剂盒（购自上海卡奴生物科技有限公司）操作步骤进行。

1.1.2 判断标准 病毒感染结果的判断标准为：临界值（CO）=阴性对照均值+0.15；百合黄瓜花叶病毒（CMV）阴性=样品OD值< 临界值；百合黄瓜花叶病毒（CMV）阳性=样品OD值> 临界值。

1.2 RT PCR检测法

1.2.1 材料及主要试剂 从田间采集有症状的病叶进行DAS-ELISA方法检测，然后依据检测结果，将呈阳性的卷丹百合病叶用于百合黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测。

主要试剂：植物类病毒RNA核酸提取试剂盒（武汉哇哇噻纳技术开发有限公司）；cDNA第一链合成试剂盒（北京天根生物科技有限公司）；DNA凝胶纯化回收试剂盒（Vigene Biotech公司）；RT-PCR反应所采用的试剂High dNTPs-Taq DNA多聚酶、10×PCR Buffer均购于上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 引物设计与合成 根据NCBI（美国国立生物技术信息中心）已登记的CMV病毒的CP基因序列，利用计算机软件设计特异性引物。上游引物：5'-CTGCGGATGCCACCTTCA-3'，下游引物：3'-GTGGGAATGCGTTGGTGC-5'，由上海生工生物工程有限公司合成引物，扩增产物预期大小为514 bp。

1.2.3 总RNA的提取和RT-PCR 研钵灭菌待用，称取0.5 g新鲜的百合病叶放入研钵，加入液氮迅速研成粉末，其他步骤按照RNA核酸提取试剂盒说明书进行。提取的RNA通过1%琼脂凝胶和溴化乙锭（EB）染色后，进行电泳检测质量[12]，最后保存在-80 ℃冰箱待用。将提取的卷丹百合病叶的RNA合成cDNA。具体操作步骤按照天根公司cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。

反转录反应体系为50 μL，其中包括模板cDNA 4 μL， Taq酶0.6 μL，上游和下游引物各1 μL，其他组分和操作步骤参照vitrogen反转录酶说明书。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。再取4 μL PCR产物进行电泳检测，用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳25 min，使用Gene Snap凝胶成像仪拍照。再送样至南京金斯瑞生物科技有限公司对纯化的PCR产物进行测序，最后将测序结果进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 DAS ELISA检测结果

从图1的显色反应结果可知，在12个待检样品中显色为阳性的有9个，不显色呈阴性的有3个，酶标仪读取的数据结果表明（表1），其中显色的9个样品OD值大于临界值，不显色的3个样品OD值小于临界值，这与显色反应的结果完全一致，检出率达75%，从而初步推断黄瓜花叶病毒侵染了龙山卷丹百合。

2.2 RNA提取

由图2可见，提取的总RNA条带清晰，且均无明显的拖尾现象，通过核酸蛋白检测仪检测得知，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间，因此说明RNA完整性和纯度质量高。

2.3 RT-PCR测序结果及序列分析

以cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。由图3可知，泳道4、5和6为病叶样品，呈阳性，确定携带黄瓜花叶病毒，该病叶样品RT-PCR扩增产物条带约为500 bp，与预期片段大小相符，并与阳性对照片段大小一致，这说明RT-PCR具有一定的特异性，能检测出卷丹百合病叶中的黄瓜花叶病毒。测序结果表明，黄瓜花叶病毒扩增产物共含有514个核苷酸，将获得的CMV扩增序列在NCBI数据库进行BLAST，结果表明与已登录的荷兰地区分离物AJ131618、AJ131619和AJ131615的同源性达96.7%，说明该序列确为CMV序列。从而进一步表明DAS-ELISA检测呈阳性的百合样品感染了百合黄瓜花叶病毒。

3 结论与讨论

目前，百合病毒病的研究逐渐系统化和清晰化，但主要集中在切花百合的研究上，CMV作为侵染百合的主要病毒之一，虽在世界上已有不少报道，但这是首次在龙山卷丹百合中报道。卷丹百合是龙山特色农业的重要组成部分，栽培历史长达50多年，近年来栽培面积却逐年缩减，究其原因主要是多年的无性繁殖，百合病毒病侵染严重，导致引种种球质量和产量的降低，打击了农户的积极性。黄瓜花叶病毒的侵染主要是引起百合花叶病，表现为花叶、叶扭曲、叶面凹凸不平的泡斑；重病植株矮化、鳞片短甚至不能开花[13]。通过产区的实地调查发现，植株矮化和叶片簇生现象非常明显，因此开展龙山卷丹百合病毒病调查意义重大。本研究将采回的病株分别采用DAS-ELISA和RT-PCR检测技术，对卷丹百合感染CMV的情况进行检测，确定湖南龙山产区的卷丹百合已被百合黄瓜花叶病毒感染。

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