浅谈痰标本涂片培养

王伟

摘要：目的：了解感染患者的口腔痰液标本原始涂片检查方法及检测结果的影响。方法：对30份痰液标本检查结果与细菌培养鉴定进行分析研究。结果：口痰液标本30份以呈纯培养或优势生长为阳性，涂片与培养结果符合率68.6%。结论：高质量痰标本涂片染色或湿片直接镜检，可取得最早期快速的初步病原学诊断，对一些特殊病原体如抗酸杆菌、放线菌、奴卡菌，一些真菌以及伊氏肺袍子菌、寄生虫等引起的感染，可做出较明确的初步诊断。

关键词：痰标本涂片；痰液细菌培养

[中图分类号]R441.5 [文献标识码]A [文章编号]1672-8602（2015）02-0461-01

引起呼吸系统感染的病原谱非常广，包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体等微生物以及原虫、吸虫、绦虫等寄生虫。目前细菌和病毒仍是呼吸系统感染最常见的病原体。临床常用的病原检测方法包括痰涂片镜检、培养鉴定等。通过痰涂片、培养等检查可明确呼吸道感染的病原体类型，通过病原体培养还可以进行药物敏感试验，指导临床医师合理用药。30份痰液标本进行涂片检查并培养结果进行分析，提高痰培养准备性。

1.材料与方法

1.1标本来源 2014年5月-6月收治的门诊及住院患者痰液标本30份。

1.2采集 病人清晨起床后，用清水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰于灭菌容器内，立即送检验。对于痰量少或无痰的病人，可采用3%～5%氯化钠溶液5 mL雾化吸入约5 min进行导痰，使痰液易于排出。对咳痰量少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽。采集后的痰，收集于灭菌容器中立即送检，因为室温下延搁2h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的分离率。

1.3方法

1.3.1不染色涂片法 痰标本直接涂片检查病原体常用的有湿片法、悬滴法和毛细管法等，主要检查病原体的动力和运动状况。该法对检查肺部寄生虫感染具有独特的诊断价值。该法的缺点是阳性率一般不高，需结合其他检查方法以提高检查的敏感性。

1.3.2染色涂片法 标本经涂片、干燥、染色后再检查对鉴别甚至诊断病原体有重要的意义。可通过痰直接涂片光镜检查判断是否为感染性痰液或痰液标本受到口腔寄生菌的污染。若每低倍视野鳞状上皮细胞<10个、白细胞>25个或鳞状上皮细胞：白细胞<1：2.5，则表示痰液标本较好，受到的污染较轻；低倍镜下若痰液标本每视野>25个鳞状上皮细胞，则标本受污染的可能性大。涂片染色方法较多，革兰染色可将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两大类；通过抗酸染色可以发现抗酸杆菌；Gomori（GMS）六亚甲基四胺银染色或亚甲胺蓝染色（TBO）可显示卡氏肺孢子虫包囊等。经过染色，可以观察病原体形状、大小、排列、染色特性以及有无荚膜、鞭毛、芽孢和异染颗粒等特殊结构，有利于病原体的诊断和鉴别。在细菌培养和药敏试验尚未获得结果的情况下，通过染色法检查细菌有助于临床医生初步选用抗生素。

1.3.3细菌培养鉴定

1.3.3.1需氧培养法 将细菌接种于培养基，在大气条件下，培养18～24小时。该方法需氧菌和兼性厌氧菌均可在培养基上生长。但一些生长缓慢的细菌如结核杆菌需培养3～7天甚至1个月才能生长。需要培养较长时间的细菌，接种后应将试管塞好用石蜡凡士林封固，以防培养基干燥。

1.3.3.2二氧化碳培养法 将细菌接种于培养基上，再置于二氧化碳环境中培养的方法。如布氏杆菌需要在一定的二氧化碳环境中才能生长。

1.3.3.3厌氧菌培养法 将细菌接种于培养基上，再置于无氧环境中进行培养的方法：厌氧菌培养的标本采集和送检必须严格，一般来说，经口腔咳出的痰液对厌氧菌培养无送检价值。采集支气管分泌物做厌氧菌培养，可通过以下方式：①经环甲膜穿刺。②经皮肺穿刺。③经PBAL方式：标本采集后应立即送检并及时处理。厌氧菌首先經过初代培养，然后进行次代培养。其初步鉴定常常根据细菌形态、革兰染色特性、菌落性状、吲哚和接触酶反应等特征进行判定，而最后确诊需要对培养细菌进行生化特性及终末产物等多项检查。

2.结果

待细菌培养长出后，根据菌落计数和痰液标本的稀释倍数，计算出每毫升痰液所含细菌浓度，通常以每毫升菌落形成的单位（CFU/mLl来表示，然后确定是否为致病菌及细菌的种类。口痰液标本30份以呈纯培养或优势生长为阳性，涂片与培养结果符合率68.6%。

3.讨论

涂片光镜检查操作简便，通过痰标本涂片检查可取得最早期的初步病原学诊断，对有些病原体如抗酸杆菌、放线菌、奴卡菌、真菌咖念珠菌、隐球菌、曲菌和毛霉菌1以及卡氏肺孢子虫、寄生虫等引起的感染做出较明确的诊断。细菌培养包括需氧菌培养、厌氧菌培养、结核菌培养以及真菌培养等。不同细菌培养条件各异，因此应选择相应的培养基、接种方法和培养方法。

痰标本的消化与洗涤由于上呼吸道有正常菌群定植，因此在做痰培养前，标本接种前的预处理尤为重要，基本要求应该首先对痰标本进行洗涤（痰标本先加人10～20 mL无菌生理盐水中洗涤3次），然后用乙酰半胱氨酸等蛋白水解酶等消化液进行消化，将均质化后的标本离心3 000 r/min离心10min，弃去上清液取沉淀物接种培养基。痰液消化过程有助于痰核内部细菌的暴露，提高痰标本培养的阳性检出率，尤其是能显著提高流感嗜血杆菌检出率。微生物实验室收到标本后应立即处理、接种。所用的培养基包括分离和鉴别革兰阳性菌的血平板、革兰阴性菌鉴别的平板如麦康凯平板，以及接种富含营养的巧克力平板以提高分离流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和脑膜炎奈瑟菌的阳性率并将其置于5%-10%的CO2、35-37℃的环境中孵育。

痰液化后进行系列稀释，分别接种于培养皿。根据菌落计数和痰标本稀释倍数，计算出每毫升痰中各种细菌的含菌量。也可采用0.001 mL标准环接种液化处理的痰标本。痰定量培养分离的致病菌或条件致病菌浓度≥107CFU/mL，可认为是肺部感染的病原体；～

标准定量培养方法操作烦琐，临床实验室推广困难。为此，建议采用痰半定量方法，即用接种环将痰液在血平板、巧克力平板上按规定划线要求做四区划线接种标本进行培养，每划一区后均须加热接种环，使细菌在平板上生长数逐级下降。目前，国际上较为认同的半定量判断标准。优势菌可定义为生长菌落为（+++），或（+++）以上。高质量的标本可以只鉴定和报告优势生长的需氧菌和兼性厌氧菌。只在原始区生长的少数菌不必做常规鉴定，除非临床或直接革兰染色提示可能为感染的病原菌。临床医生应根据病人情况判断各种细菌的临床意义。