高效液相色谱—串联质谱法测定猪血中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶

杨挺 许秀琴 赵健 章豪 吴银良 王立君 朱勇

摘要：建立高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定猪血中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的方法。样品中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶用乙腈提取，UPLC-MS/MS进行分析。分析时采用Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.10%甲酸水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正电子（ESI+）模式电离，多反应监测模式检测，外标法进行定量。结果表明：盐酸可乐定和盐酸赛庚啶标准溶液在1.0～50 μg/L范围内，峰面积与含量呈线性相关。盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的检出限均为0.20 μg/kg，样品中添标回收率在85%～110%之间，相对标准偏差小于10%。

关键词：高效液相色谱-串联质谱；盐酸可乐定；盐酸赛赓啶；猪血

Determination of Clonidine Hydrochloride and CyproheptadineHydrochloride in Swine Blood by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YANG Ting，XU Xiuqin， ZHAO Jian， ZHANG Hao，WU Yinliang， WANG Lijun， ZHU Yong

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）

Abstract： A simple and sensitive ultra performance liquid chromatography-tandem mass （UPLC-MS/MS） method for the determination of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride in swine blood was developed. Samples were extracted with acetonitrile and analyzed by UPLC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride was quantified by the external standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L. The limits of detection for clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride were both 0.2 μg/L. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations （RSD） were lower than 10%.

Key words： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； clonidine hydrochloride； cyproheptadine hydrochloride； swine blood

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001

盐酸可乐定（clonidine hydrochloride，C9H9Cl2N3·HCl）和盐酸赛庚啶（cyproheptadine hydrochloride，C21H21N·HCl）通常作为人用药品[1]。盐酸可乐定主要用于治疗高血压、高血压急症、偏头痛、绝经期潮热、痛经等症状，盐酸赛庚啶主要用于治疗荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎、皮肤瘙痒、鼻炎、偏头痛、支气管哮喘等症[2-3]。自发现将可乐定添加于饲料中，可以促进猪的生长，并提高瘦肉率，赛庚啶也有一定的刺激食欲的功能后[4]，有发现国内畜产品养殖者将这两种药物滥用于饲料中，以促进猪的生长[5-8]。这种滥用，势必会对人类的健康带来危害，曾发生过可乐定的中毒事件[9-11]，造成34人出现头晕、昏迷并入院治疗。农业部于2010年12月27日发布1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。目前，对于盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定主要集中于医药领域[12-13]。陈其煌[1， 14]测定了猪尿和猪肝中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶，曹莹[15-16]、李丹妮[4]等测定了饲料中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。柯光明等[17]测定了家兔血液中的可乐定含量，孙成文等[18]测定了人血中的可乐定含量。由此可以看出，可乐定等药物进入动物体内以后，会在血液中呈现出一定的浓度，因此，通过测定血液中药物的浓度，便可知药物是否在动物体内存在。从活体动物抽血检测并不会对动物造成很大的影响，因此测定活体动物的血液可有效的解决兽药残留检测的时滞性问题。本研究采用了高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定猪血中的可乐定和赛庚啶含量，检测限低准确度高，旨在为猪血样品中可乐定和赛庚啶的测定提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血为抽取的生猪血液，生猪来源于浙江奉化滕头村养猪场。

盐酸可乐定标准品、盐酸赛庚啶标准品购于中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈（色谱纯）美国默克公司；实验用水为Mili Q超纯水仪所制超纯水；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

UPLC-XEVO超高效液相色谱质谱仪美国Waters 公司；SIGMA3K15离心机北京博励行有限公司；RT SPE全自动固相萃取仪美国Caliper公司；Mili Q 超纯水仪美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1标准溶液的配制

1.3.1.1 标准储备液

称取盐酸可乐定、盐酸赛庚啶标准品10.0mg定容至100mL甲醇中，质量浓度为100mg/L，―18℃保存，保质期为6 个月。用甲醇稀释为20.0 mg/L的中间液。

1.3.1.2 标准工作液

用流动相（甲醇：0.1%甲酸水=20：80）稀释标准中间液20.0mg/L的盐酸可乐定、盐酸赛庚啶分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L的标准工作液，现配现用。

1.3.2样品前处理

吸取血浆样品1.0 mL，涡旋30s，加入乙腈5 mL，涡旋3 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用0.2μm滤膜过滤，于50℃水浴用氮气流吹干。残渣用流动相溶解后，过0.2μm滤膜，待测。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1min；3.5min，50%B保持1.4 min。流速：0.2mL/min，柱温箱温度：25℃；进样量10μL。

1.3.4质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；正离子方式检测，采用多反应离子监测，内标法定量。喷雾毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度500℃，去溶剂气流速为1000L/h，碰撞气流速0.20 mL/min，放大倍数为600。

1.4 数据分析

数据应用软件MassLynx version 4.1进行分析。

2 结果与分析

2.1提取溶剂的选择

根据盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的化学性质及参考文献[19-20]，选择用乙腈来提取猪血中的可乐定和赛庚啶。

2.2 液相色谱的测定结果

用1000μg/L的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶溶液来确定合适的离子。最终确定了盐酸可乐定的母离子为230.16，子离子为171.79、159.75；盐酸噻庚啶的母离子为288.8，子离子为191.2、215.2。图3为盐酸可乐定和盐酸噻庚啶的标准溶液、加标样品和空白样品色谱图。

1.盐酸噻庚啶的色谱图（母离子288.8，子离子191.2）；2.盐酸噻庚啶的色谱图（母离子288.8，子离子215.2）；

3.盐酸可乐定的色谱图（母离子230.16，子离子171.79）；4.盐酸可乐定的色谱图（母离子230.16，子离子159.75）。

图1 可乐定赛庚啶标准溶液（a）、可乐定赛庚啶加标样品（b）、空白样品（c）色谱图

Fig. 1 MRM Chromatograms of standard solution of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride （a）， fortified sample （b）， and blank sample （c）

由图1可知，空白样品于峰位置处无吸收峰，说明空白样品不含盐酸可乐定和盐酸噻庚啶，对样品的测定无干扰；加标样品的峰位置与标准溶液峰位置完全吻合，说明此方法可以很好的用于测定盐酸可乐定和盐酸噻庚啶。

2.3标准曲线与线性范围

经UPLC-MS/MS测定，以盐酸可乐定和盐酸噻庚啶的质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果显示：盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的回归方程和相关系数分别为y=4270.2x+18352（R2=0.9986），y=4118.8x+6156.2（R2=0.9978）。在质量浓度内线性范围良好。

2.4 检出限和定量限

根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，按照1.3.2节进行操作，测定其实际信噪比。以信噪比RS/N=3为检测限，以信噪比RS/N=10为定量限。结果表明，猪血样品中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的检出限均为0.2μg/L，定量限均为0.6μg/L。

2.5精密度和回收率

取猪血样品1mL，制成1.0、2.0、4.0μg/L的加标样品，按照1.3.2节进行操作，每个添加水平重复3次，每次每个质量浓度做5个平行添加样品，取其平均值进行定量分析。

加标质量浓度

/（μg/L）

测定值

/（μg/L）

回收率/% 精密度/%

批内 批间

1.0 0.94±0.06 94 5.7 5.7

0.88±0.08 88 3.2 5.3

0.91±0.07 91 2.9 2.9

2.0 1.85±0.06 93 3.5 3.5

1.88±0.09 94 4.8 5.0

1.92±0.08 96 3.2 3.2

4.0 4.08±0.13 102 1.5 1.5

3.89±0.09 97 1.7 3.6

3.91±0.06 98 1.2 1.2

加标质量浓度

/（μg/L） 测定值

/（μg/L）

回收率/% 精密度/%

批内 批间

1.0 0.95±0.07 95 5.8 5.8

0.86±0.09 86 4.9 6.1

0.92±0.06 92 3.2 3.2

2.0 1.86±0.06 93 3.9 3.9

1.89±0.09 95 4.2 5.4

1.91±0.08 96 5.1 5.1

4.0 4.09±0.11 102 2.6 2.6

3.62±0.08 91 3.7 4.9

3.75±0.09 94 2.9 2.9。

3 结 论

本实验研究了一种猪血样品中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定方法。利用乙腈作为提取液，过膜后用UPLC-MS/MS法测定。应用这种方法测定猪血中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶，简便、快捷，检出限低，回收率高，为猪血中可乐定和赛庚啶的测定提供了可靠的技术手段。

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