基于SSR标记的菠萝种质DNA指纹图谱构建

王健胜　贺军虎　陈华蕊　陈业渊

摘 要 以来自9个国家或地区的26份菠萝种质为材料，利用SSR标记进行了DNA指纹图谱的构建。筛选出多态性高、稳定性好的8对SSR引物共检测到35个多态性位点，每对引物的多态性位点数平均为4.38，引物的多态性条带百分比平均高达92.92%，PIC值介于0.26～0.39之间，平均为0.33。利用这8对SSR引物构建了26份菠萝种质的指纹图谱，并对菠萝种质做遗传相似性分析和聚类分析。结果表明，菠萝种质遗传相似系数分布在0.421～0.974之间，平均为0.689，26份菠萝种质在遗传相似系数0.633处被划分为3类。该研究结果将为菠萝种质鉴定、分类及分子育种提供重要科学依据。

关键词 菠萝；SSR；指纹图谱

中图分类号 S668.3 文献标识码 A

Abstract DNA fingerprints were constructed for 26 pineapple lines originated from nine countries or regions based on SSR marker. Totally， 35 polymorphic alleles were detected using eight SSR primers with the higher polymorphism and the better stability， with an average 4.38 polymorphic alleles for each primer. For SSR primers， the percentages of polymorphic bands to total producing bands reached 92.92%， and the polymorphism information content values varied from 0.26 to 0.39 with an average of 0.33. DNA fingerprints were constructed for 26 pineapple germplasms with the eight SSR primers. The genetic similarity analysis and cluster analysis were also conducted for these pineapple lines， and the genetic similarities coefficient among pineapple lines ranged from 0.421 to 0.974 with an average of 0.689. The 26 pineapple germplasms were divided into three groups at the genetic similarities coefficient of 0.633. These results would provide an important scientific basis for pineapple germplasm identification， classification and molecular breeding of pineapple.

Key words Pineapple； SSR marker； DNA fingerprint

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.015

菠萝[Ananas comosus（L.）Merr]属凤梨科凤梨属，是一种重要的多年生热带水果。菠萝起源于南美洲，中国菠萝种植是在国外菠萝引种的基础上逐步发展起来的。一直以来，中国引进了大量的菠萝种质，而围绕这些种质有效利用及保护方面开展的研究甚少，加之国内外菠萝种质交流的日益频繁，使中国菠萝种植及培育体系较为混乱，因此，开展菠萝种质相关研究已迫在眉睫。

在菠萝种质研究中，不同菠萝种质的有效区分是进行菠萝遗传育种、栽培、种质资源保护等其它研究的重要基础，而基于传统表型性状进行菠萝种质研究已表现出越来越多的缺点。利用分子标记技术进行DNA指纹图谱构建是目前植物种质研究中最为有效的手段，其已在水稻[1]、棉花[2]、枣[3]、玫瑰[4]、木薯[5]、火龙果[6]等植物中得到了较为广泛的应用。目前，多种类型分子标记，如AFLP[7]、RAPD[8]、ISSR[9]、SSR[10]、SRAP[11]等已被有效用于植物DNA指纹图谱构建中，其中SSR标记技术由于其具有共显性好、多态性丰富、稳定性好且适合自动化分析等优点而被广泛采用，因此，国际植物新品种保护联盟（UPOV）在2005年拟定的分子测试指南中将SSR确定为构建DNA指纹图谱的首选标记。虽然部分分子标记已逐步应用于菠萝研究中，但至今有关菠萝DNA指纹图谱构建的报道甚少[12]。基于此，本研究利用SSR技术构建了中国26份菠萝种质的DNA指纹图谱，以期为菠萝种质的分子鉴定、保护和科学利用提供有效技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所利用的26份菠萝种质材料来源于世界上9个不同国家或区域（表1），主要包括中国台湾、中国海南、中国广州、巴西、日本、印度尼西亚、泰国、哥斯达黎加、毛里求斯。试验材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合工作浓度，备用。

1.2.2 SSR标记检测 PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成，SSR引物见表2。PCR反应总体积为20 μL，包括1.0 μL基因组DNA（40 ng），2.0 μL引物（20 mmol/L），2.5 μL 10×PCR缓冲液（含Mg2+），2.5 μL底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和11 μL ddH2O。

SSR-PCR扩增程序：94 ℃ 2.5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 8 min。扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，待凝胶自然风干后进行带型统计。

1.3 数据统计及分析

以0、1统计SSR扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，并建立分子数据矩阵。计算多态性位点百分率P/%=（k/n）×100，其中k是多态位点数，n为所测位点总数。SSR位点的多态性信息量（PIC）按如下公式计算：PIC=1-ΣPi2，式中Pi表示第i个等位位点出现的频率。利用NTSYS-pc2.10软件通过非加权平均法（UPMGA）计算菠萝种质间的遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 多态性引物的筛选及分析

利用表型性状差异较大的2个菠萝材料，即MD2和台农14，对73个菠萝SSR引物进行了筛选，从中筛选出扩增位点丰富、带型清晰稳定的多态性引物20个，选率为27.39%。为了提高指纹图谱构建的效率，研究又从20个多态性引物中选取8个综合表现较好的引物用于菠萝指纹图谱构建，这8个SSR引物详见表3。从表3可以看出，SSR引物扩增的等位位点数分布在3～6个之间，平均为4.75个，多态性位点数目为3～6个，平均为4.38个；同时可以看出，SSR引物多态性位点百分比都较高，除AY098521、CO730888外，其它引物的多态性百分比都达到了100%，平均达到了92.92%。8个SSR引物的多态性信息量较高，其变化范围为0.26～0.39，平均为0.33。其中引物DT338091对26份菠萝种质的扩增情况见图1。

以上分析结果表明，所选用的8个SSR引物综合表现都较好，比较适合进行菠萝种质DNA指纹图谱的构建。

2.2 菠萝种质遗传相似性分析

利用8个SSR引物对菠萝种质进行了分子检测，以此为基础对菠萝种质作遗传相似性分析（表4）。26份菠萝种质间遗传相似系数的差异较大，其变化范围是0.421～0.974，平均为0.689。在所有菠萝种质中，来自哥斯达黎加的MD2分别与来自泰国的Phuket、来自日本的Soft-Touch、来自毛里求斯的Victoria间，以及来自台湾的金菠萝与Phuket、Victoria间的遗传相似系数最小，只有0.421，说明其亲缘关系相对较远。另一方面，Bogoul与Honey-Bright，早熟香水与Perola，密宝与台农16，新品系-1与早熟香水、Perola，印尼无刺与新品系、早熟香水、Perola，以及Cacaine与密宝、台农16间的遗传相似系数最大，达到了0.974，表明其亲缘关系相对较近。从26份菠萝种质间遗传相似系数的平均表现来看，中国菠萝种质的遗传异质性相对较好。

2.3 菠萝种质DNA指纹图谱的构建

利用多态性位点丰富且带型清楚的SSR引物进行了菠萝种质DNA指纹图谱的构建，为了提高DNA指纹图谱的准确度和精确度，本研究共选用了8个SSR引物，不同菠萝种质DNA指纹图谱详细信息见表5。从表5可以看出，8个SSR引物扩增共产生了35个有效基因位点，这35个位点在不同菠萝种质间具有很大的差异，利用其可以有效的将26份菠萝种质进行区分。研究同时发现，利用多态性位点比较丰富的单个SSR引物，如DT338091、DT336561，也可以将部分菠萝种质进行区分，但由于其区分精度相对较差，因此会导致菠萝种质间区分准确性的下降，而不同引物多个有效基因位点的结合将会获得较为准确的结果。

2.4 不同菠萝种质聚类分析

基于SSR标记检测获得的Nei's遗传相似系数，构建了26份菠萝种质的遗传聚类分析图，结果见图2所示。从图2可见，根据遗传关系的远近，将26份菠萝种质大致可被划分为3个类群，即类群Ⅰ、类群Ⅱ和类群Ⅲ，其中，第Ⅰ类群包含4个菠萝种质，分别来自4个不同的地区，即泰国、毛里求斯、中国广州和中国台湾；构成第Ⅱ类群的菠萝种质数量最多，共有20个，这些菠萝种质包括来自日本的4个、印度尼西亚的3个、巴西的1个、中国台湾的8个、中国海南的2个和中国云南的2个；第Ⅲ类群共包括2个菠萝种质，分别来自中国台湾和哥斯达黎加。

3 讨论与结论

与其它主要农作物相比，菠萝基因组研究较为滞后，而国外内开展菠萝SSR标记开发的研究甚少[15-16]。虽然SSR标记数量较少，但本研究获得了较为满意的引物筛选结果，在选择的可用于DNA指纹图谱构建的8个核心引物中，多数引物的多态性条带百分比均达到了100%，引物多态性条带百分比平均也达到了92.92%。SSR引物扩增的等位位点也较为丰富，其数目分布在3～6之间，这种较理想筛选结果可能与研究所用菠萝材料存在一定的相关性，本研究的26份菠萝种质来自世界上9个不同的国家或地区，而种质来源地广泛性在一定程度上决定了种质群体的异质性。本研究的SSR标记扩增位点数目与童和林等[12]研究结果存在一定差异，其利用的SSR标记扩增位点达到了8～15个，造成这种差异的原因是多方面的，与SSR引物筛选、研究材料差异及带型统计等都可能有关，SSR引物的选择不仅要考虑其扩增位点的多少，更要注意该引物在所有研究材料中的扩增效果，如果只具有较多扩增位点但在部分材料中扩增效果不好的SSR引物也不能选作目标SSR引物，同时研究材料不同也是导致SSR标记扩增位点差异的因素之一，另外，SSR扩增带型统计标准的不同也会影响扩增位点数量，本研究只对SSR引物扩增的主带进行了统计。

在菠萝DNA指纹图谱构建方面，不同SSR引物也表现出了不同的特性，一般来说，扩增等位位点越多的引物其区分不同菠萝种质的能力相对更强，但通过单个SSR引物构建的指纹图谱无论是在种质区分度还是准确性方面都会较低，而多个核心引物的联合无疑是构建DNA指纹图谱的有效途径，当然它也是目前植物DNA指纹图谱构建普遍采用的基本策略。本研究利用8个核心SSR引物，构建了菠萝种质较为理想的DNA指纹图谱，8个SSR引物所产生的35个有效基因位点可对26份菠萝种质进行准确有效的区分。另外，本研究认为，在菠萝DNA构建中，选用SSR标记的数量也甚为关键，因为其不仅影响着DNA指纹图谱的准确性和有效性，它也决定着所能区分菠萝种质的数量，而SSR标记数量的确定主要取决于单个SSR标记扩增多态性位点的多少，对某一特定数量菠萝种质而言，单个SSR标记扩增位点越多，DNA指纹图谱构建中选用的SSR标记数量则越少。与童和林等[12]研究相比，本研究菠萝DNA指纹图谱构建中选用的引物数量较多，其主要原因就是由于本研究所利用的SSR标记有效多态性位点数量较低。

在利用SSR标记构建菠萝种质DNA指纹图谱的同时，本研究也对26份菠萝种质间的亲缘关系作了初步探讨。从聚类结果可以看出，密宝、台农16和Cacaine间的亲缘关系很近，这与其系谱关系基本符合，由于密宝和台农16都来自对同一父母本杂交后代个体的选择，即Cacaine和roguh，该结果也与窦美安等[17]利用SRAP对菠萝种质的分析结果基本一致。来自中国广东的徐利与Phuket、Victoria和台农4号被聚在一起，表明这4个种质间具有较近的亲缘关系，徐利很可能来自对其余3个种质中某2个种质杂交后代的选择或者对某个种质天然变异单株的选择。新种质新品系-1与早熟香水的遗传相似系数较高，为0.974，在聚类分析中也被聚为一类，这表明两种质间具有很近的亲缘关系，新品系-1很可能来自对早熟香水后代或变异单株的筛选培育。本研究中部分菠萝种质聚类分析结果与利用AFLP[18]、SCoT[19]等其它类型分子标记的分析结果基本一致。从遗传相似系数来看，26份菠萝种质的遗传相似系数较低，平均为0.689，表明供试菠萝种质的遗传异质性较好，下一步应加强部分优良种质在菠萝育种中的有效利用研究。

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