益心泰颗粒对慢性心力衰竭兔心肌组织C—Myc表达的影响

李雅等

摘要：目的 探讨益心泰颗粒对慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）兔心肌组织原癌基因C-Myc蛋白及mRNA表达的影响。方法 采用阿霉素耳缘静脉注射建立CHF兔模型，将成模家兔随机分为模型组、氯沙坦钾组和益心泰低、中、高剂量组，另设正常组。各给药组给予相应药物灌胃，模型组和正常组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续4周。观察心功能指标，检测心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、E峰与A峰的比值（E/A）显著降低（P<0.01），C-Myc蛋白及mRNA表达明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组LVEF、LVFS、E/A显著升高（P<0.01），C-Myc蛋白及mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 益心泰颗粒可有效抑制心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达，提高心功能。

关键词：益心泰颗粒；慢性心力衰竭；原癌基因；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0063-04

Effects of Yixintai Granules on Expression of C-Myc mRNA and Its Protein in Myocardial Tissues of Rabbits with Chronic Heart Failure LI Ya1， GUO Zhi-hua2， WU Gang-qiang2， TANG Yun2， MAO Xiang-ping3， WANG Yue-ai2， SUN Tao2 （1.Pharmacy College， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410007， China； 3.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410005， China）

Abstract：Objective To explore the effects of Yixintai Granules on expression of C-Myc mRNA and its protein in myocardial tissues of rabbits with chronic heart failure （CHF）. Methods CHF rabbit models were established by ear marginal vein injection of adriamycin. Successfully modeled rabbits were divided into the model group， the Losartan Potassium group， the high-， medium-， and low dose Yixintai Granules groups. Besides， a normal control group was set up. Administration groups were given relevant medicine for gavage， equal volume of physiological saline was administered to rabbits of the model group and the normal control group by gastrogavage. The intervention lasted for 4 weeks， once per day. Echocardiographic indexes and mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissue were detected after 4 weeks of medication. Results Compared with the normal group， the LVEF， LVFS， and E/A of the model group decreased significantly （P<0.01）， but mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissues increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the LVEF， LVFS， and E/A of YG groups and Losartan Potassium group increased significantly （P<0.01）， but mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissues decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yixintai Granules can effectively inhibit the expression of mRNA and protein expression of C-Myc， and improve cardiac function.

Key words：Yixintai Granules；chronic heart failure；C-Myc；rabbits

基金项目：国家自然科学基金（81373816）；湖南省研究生科研创新项目（CX2013B327）

通讯作者：郭志华，E-mail：guozhihua112@163.com

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心血管疾病的终末期表现，随着年龄的增长，其发病率逐渐增加，目前已成为危害人类健康的主要疾病之一。近年来，有研究表明，原癌基因C-Myc等作为转录网络中心节点，与CHF关系密切[1]。但C-Myc的功能作用在CHF的发病机制尚不清楚。前期研究表明，益心泰可改善心衰大鼠的心肌重构和心功能[2]。本研究采用益心泰颗粒干预阿霉素耳缘静脉注射致CHF模型兔，探讨其治疗CHF的作用机制，为其临床推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

成年健康普通级新西兰兔150只，雌雄各半，体质量1.7～2.0 kg，长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号SCXK（湘）2009-00121。室温23 ℃饲养，湿度55%，通风，分笼饲养，饲料及水均由湖南中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物

益心泰颗粒由黄芪、丹参、红花、泽泻、猪苓等组成，每克益心泰颗粒含原药材3.1 g，湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供；氯沙坦钾，杭州默沙东制药有限公司，批号20140212；盐酸阿霉素，深圳万乐药业有限公司，批号20140703。

1.3 主要试剂与仪器

C-Myc抗体（货号BA1284-2），武汉博士德生物技术有限公司。TP-2200B电子天平，湘仪天平仪器设备有限公司；IE33彩色多普勒超声诊断仪，荷兰Philips公司；Nova Blot半干法转印仪、SDS-PAGE垂直电泳仪及ImageQuant LAS 4000mini凝胶成像仪，美国GE Healthcare公司；PCR仪，德国Eppendorf公司；HT7700型投射电镜，日本日立高新技术公司。

1.4 造模

参照文献[3]方法。将盐酸阿霉素配制成浓度为1 mg/mL 的溶液，经耳缘静脉注射，药量为1 mg/kg，每周2次，连续8周。造模后左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、E峰与A峰的比值（E/A）显著降低（P<0.01），室间隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）、左室收缩末期内径（LVIDs）、左室舒张末期内径（LVIDd）显著升高（P<0.01），且家兔出现精神差、少动、纳食减少等CHF表现，说明造模成功。

1.5 分组与给药

将成模兔随机分为5组，模型组（21只）、氯沙坦钾组（20只）和益心泰低、中、高剂量组（各21只），另设正常组（19只）。于实验第9周开始灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，益心泰低、中、高剂量组分别予益心泰颗粒2.1、4.2、8.4 g/kg灌胃，氯沙坦钾组予氯沙坦钾2.73 mg/kg灌胃。连续4周，1次/d，灌胃体积为10 mL/kg。用药4周内，模型组、氯沙坦钾组及益心泰低、中、高剂量组因腹泻致死2、1、1、1、1只，而正常组兔全部存活。

1.6 取材

用药4周后，行心脏彩超，检测心功能指标后，处死全部实验兔，取兔心肌组织，切成多份，100 mg/份，待测。

1.7 观察指标

1.7.1 心功能指标检测 应用彩色多普勒超声诊断仪检测LVEF、LVFS、E/A。

1.7.2 心肌组织原癌基因蛋白表达 心肌组织冰上匀浆60 min，充分裂解后，4 ℃、21 000×g离心30 min，取上清液，Bradford法测定蛋白质，制备SDS-PAGE浓缩胶与分离胶、上样，电泳，先16 mA/gel电泳15 min，然后32 mA/gel至溴芬兰指示剂到达胶的底部时即停止，然后0.8 mA/cm2转移1、2、3 h，封闭、配一抗、上一抗、上二抗及Actin，显影成像，计算其与β- actin的比值。

1.7.3 心肌组织原癌基因mRNA表达 提取总RNA：Trizol抽提总RNA，测定OD值，检测RNA纯度及浓度并定量。反转录合成cDNA：42 ℃、60 min，75 ℃、10 min，4 ℃、5 min。引物设计与合成：β-actin上游5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游5'-AGGGGC CGGACGCGTCATACT-3'；C-Myc上游5'-AGAGTTTCATCTG CGACCCG-3'，下游5'-GCTGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3'。PCR反应体系：95 ℃、5 min，94 ℃、1 min，54 ℃、1 min， 72 ℃、1 min，重复30次，然后72 ℃、5 min，4 ℃冰箱保存。凝胶电泳：扩增产物10 μL，电压120 V，1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Gel pro 4.0凝胶成像系统分析，计算C-Myc/β-actin比值。

1.7.4 心肌组织病理结构 醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察并采集图像。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示。两组间均数比较，采用成组t检验；多样本间均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益心泰颗粒对兔心功能指标的影响

与正常组比较，模型组LVEF、LVFS、E/A显著降低（P<0.01）；与模型组比较，益心泰低、中、高剂量组及氯沙坦钾组LVEF、LVFS、E/A显著升高（P<0.01）。结果见表1。

2.2 益心泰颗粒对兔心肌组织原癌基因蛋白及mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2、图1、图2。

注：1.正常组；2.模型组；3.益心泰低剂量组；4.益心泰中剂量组；

5.益心泰高剂量组；6.氯沙坦钾组（下同）

2.3 益心泰颗粒对兔心肌组织超微结构的影响

正常组肌纤维密度均匀一致，收缩带正常，线粒体正常，间质无变化；模型组肌丝坏死、溶解，只残留肌纤维轮廓；益心泰低剂量组肌丝稀疏、溶解、坏死，线粒体固缩，嵴消失；益心泰中剂量组肌丝局灶性溶解、坏死，线粒体部分空泡化；益心泰高剂量组肌原纤维清晰，肌小节明显，部分线粒体变细，空泡化；氯沙坦钾组肌丝局灶性溶解，线粒体结构尚可。结果见图2。

3 讨论

本研究采用阿霉素耳缘静脉注射致CHF模型，但阿霉素可导致结肠炎，而降低造模成功率[4]。本研究造模过程中，家兔因腹泻致死率高达20%，推测其原因，可能是家兔不耐受阿霉素的毒副作用，出现肠炎，最后因脱水而发生休克致死。Myc在成年小鼠心肌细胞表达，导致小鼠发生严重的肥厚性心肌病，最终可发展为充血性心力衰竭而死亡，并发现这些小鼠心肌细胞周期标记和DNA复制指标显著增加，电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ缺陷，由此推测其机制可能与细胞周期事件和线粒体功能失调有关[5]。C-Myc在心脏疾病中的异常改变比其他都早，故抑制C-Myc表达将成为一种非常有效地预防和治疗心肌病和CHF的范式[6]。

CHF按照其证候学特征，可归属中医“心悸”“水肿”“心痹”等范围。其总病机为本虚标实，本虚以气虚、阳虚为主，标实以瘀血、水饮居多。基于此理论，组方益心泰颗粒。方中黄芪既可补气以促进血液运行，又能利水消肿，为君药；丹参、红花为活血化瘀要药，均为臣药，黄芪、丹参红花合用，共奏益气活血化瘀之功；泽泻味甘、淡、寒，归肾和膀胱经，具有利水渗湿、泄热之功效；猪苓功专利水渗湿；泽泻、猪苓合用以加强利水消肿，共为佐药。本研究结果显示，与正常组比较，模型组心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达显著升高（P<0.01），LVEF、LVFS、E/A显著降低（P<0.01），且电镜结果显示，心肌肌丝坏死、溶解，说明CHF兔心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达升高，心肌肌丝发生坏死、溶解，心功能下降。用药4周后，益心泰低、中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01），LVEF、LVFS、E/A显著升高（P<0.01），且电镜结果显示，心肌肌丝坏死、溶解的范围缩小，说明益心泰颗粒可抑制心肌组织C-Myc蛋白及mRNA的表达，改善心肌超微结构，提高心功能。

综上可知，益心泰颗粒可有效抑制心肌组织C-Myc蛋白及mRNA表达，提高心功能，这可能是益心泰有效干预CHF的机制之一。

参考文献：

[1] Chen HB， Wang L， Jiang JF. Re-analysis of expression profiles for revealing new potential candidate genes of heart failure[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（7）：903-911.

[2] 吴华堂，吴刚强，申思，等.益心泰对漫性心力衰竭大鼠心肌重构和心功能的影响[J].湖南中医药大学学报，2014，34（7）：23-26.

[3] 张静，李庚山，李国草，等.兔阿霉素心衰模型的建立[J].心脏杂志， 2004，16（5）：437-439.

[4] Kinugawa T， Kato M， Yamamoto K， et al. Proinflammatory cytokine activation is linked to apoptotic mediator， soluble Fas level in patients with chronic heart failure[J]. Int Heart J，2012，53（3）：182-186.

[5] Lee HG， Chen Q， Wolfram JA， et al. Cell cycle re-entry and mitochondrial defects in myc-mediated hypertrophic cardiomyopathy and heart failure[J]. PLoS One，2009，4（9）：7172.

[6] Wolfram JA， Lesnefsky EJ， Hoit BD， et al. Therapeutic potential of c-Myc inhibition in the treatment of hypertrophic cardiomyopathy[J]. Ther Adv Chronic Dis，2011，2（2）：133-144.

（收稿日期：2014-11-21）

（修回日期：2014-12-18；编辑：华强）