VEGF-C及其受体VEGFR-3和D2-40在老年喉癌组织中的表达及临床意义

叶成刚 李伟利

(湖北江汉油田总医院，湖北 潜江 433124)

喉癌的发病特点为高发病率、高复发率、晚期比例高以及治疗耐受力差〔1〕。研究表明，淋巴管生成在恶性淋巴侵袭和转移过程中起到重要的作用。有研究报道，血管内皮生长因子C(VEGF-C)及其受体(VEGFR-3)可能通过促进血管内皮细胞生成影响血管、淋巴管生成，与肿瘤转移密切相关〔2〕。本研究通过免疫组化方法检测喉癌组织、癌旁组织标本中VEGF-C、VEGFR-3的表达，旨在探讨其表达水平与老年喉癌临床特征的关系，为喉癌发病机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2011年1月至2014年6月在我院手术切除的老年喉癌组织、癌旁组织(距离肿瘤切缘＞0.5 cm)标本68例，均经病理诊断证实为鳞状细胞癌，癌旁组织经病理证实为炎症和正常组织，患者术前均未行放疗和化疗;选择同期我院接受手术治疗30例患者正常喉黏膜组织标本作为对照，术后病理诊断为正常组织。老年喉癌患者中，男35例，女33例;年龄66～79〔平均(71.1±7.6)〕岁;吸烟量＞400 支/年患者 44例，≤400支/年患者24例;癌肿＞3 cm患者44例，癌肿≤3 cm患者24例;病理学分级:G1级17例，G2级23例，G3级28例;喉癌分型:跨声门型10例，声门上型32例，声门型26例;TNM分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期14例，Ⅲ期22例，Ⅳ期23例;淋巴转移组40例，无淋巴转移28例。正常对照组男16例，女14例;年龄65 ～78〔平均(70.3±6.9)〕岁。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测 应用链霉素抗生物蛋白-过氧化酶免疫组织化学染色法，所有标本经4%甲醛固定、石蜡包埋，按常规4μm制成连续的切片，用二甲苯脱去蜡、梯度乙醇脱水。用新鲜配置的3%甲醇过氧化氢处理;VEGF-C、VEGFR-3采用枸橼酸缓冲液修复抗原;D2-40使用Tris-EDTA缓冲工作液修复抗原。均加一抗(稀释浓度 VEGF-C、VEGFR-3为1∶100，D2-40为1∶50)，加入山羊血清在 4℃下孵育过夜;加入PBS缓冲液冲洗，加二抗10 min、三抗10 min，PBS缓冲液冲洗，流水冲洗，DAB显色、加入苏木素复染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.2 结果判定 VEGF-C、VEGFR-3表达由两位病理科医师在未知临床资料的情况下判定，以细胞黄色颗粒为阳性细胞。按照Fromowitz等的合计分法〔3〕，将阳性着色细胞所占百分比与细胞着色强度两者结合判定，得出阳性率，包括:(1)阳性细胞百分数为5个视野中阳性细胞的平均数占视野中细胞数的比例，阳性细胞率≤25%计0分，26% ～50%计1分，51% ～70%计2分，＞70%计3分;(2)按多数阳性细胞的染色强度计分:无色计0分，多数阳性细胞呈浅棕黄计1分，多数阳性细胞呈棕黄计2分，多数阳性细胞呈棕褐计3分，将以上两项积分相加:0分为阴性，＞0分为阳性，并计算阳性百分率。

D2-40阳性淋巴管判断标准及计数方法:参照Weidner方法进行微淋巴管计数，在高倍镜(400倍)下对淋巴管进行计数，每份计数 4个视野，取其平均值为LVD(D2-40阳性脉管数/HP)〔4〕。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行分析，计数资料用x±s表示，进行Kruskal-Wallis H检验、χ2检验，计量资料用t检验。应用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 喉癌组织、癌旁组织及正常喉组织中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表达 VEGF-C、VEGFR-3在喉癌组织、癌旁组织及正常喉组织中均有表达，差异有统计学差异(P＜0.01)。其中，VEGF-C与VEGFR-3在喉癌组织标本中的阳性表达率(73.5%，72.1%)显著高于癌旁组织(25.0%，27.9%)和正常喉黏膜组织(3.3%，3.3%)(均P＜0.01)，见表1。D2-40在喉癌组织中的表达为(8.164±3.261)，显著高于癌旁组织(2.186±0.452)和正常喉组织(2.677±0.197)(P＜0.05)。

2.2 喉癌组织中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表达与临床病理特征的关系 见表2。VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表达与临床分期、淋巴转移及临床分型有关(均P＜0.05)，与病理分级、吸烟史、肿瘤的大小和性别无关(P＞0.05)。

2.3 喉癌组织中 VEGF-C、VEGFR-3和 LVD的相关性Spearman相关分析显示VEGF-C与VEGFR-3两者表达率呈正相关(r=0.899，P＜0.01)。

表1 喉癌组织、癌旁组织及正常喉组织中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40的表达情况比较〔n(%)〕

表2 喉癌组织中VEGF-C、VEGFR-3及D2-40表达与临床病理特征的关系

3 讨论

VEGF-C是由Joukov等用亲和层析法分离得到的与肝素结合的生长因子，与VEGF-A具有高度同源性，是近年来研究的热点之一。VEGF-C可以促使血管内皮细胞分裂、增殖，从而起到促进新血管形成的作用，在这一过程中血管通透性明显增强〔5〕。VEGFR-3是酪氨酸蛋白激酶家族受体，属于VEGF-C特异性受体，主要位于淋巴管的内皮细胞，临床研究〔6〕发现，VEGF-C在多种肿瘤组织中比正常组织表达高，在选择的35个肿瘤标本中共检测到19个标本具有VEGF-C mRNA的表达。D2-40是一种淋巴管内皮细胞标志物，可以特异地与癌胚抗原M2A结合，当前作为新生淋巴管内皮细胞标志物特异性最高〔7〕。

研究结果提示，VEGF-C和VEGFR-3的表达与喉癌转移有关。恶性肿瘤中VEGF-C表达的升高并导致淋巴转移是由于恶性肿瘤细胞产生的VEGF-C与VEGFR-3结合后快速产生磷酸化，诱导胞质内信号的传导，进而使DNA有丝分裂旺盛，引起淋巴管内皮细胞增生从而导致淋巴管增生，使淋巴管的通透性增高，增大肿瘤淋巴道转移的可能性〔7，8〕。

本研究提示D2-40可能参与喉癌的发生和发展。在乳腺癌、胃癌和口腔鳞状细胞癌等肿瘤中证实LVD可以作为肿瘤淋巴管生成的重要指标，国内外学者研究发现VEGF-C及其受体VEGFR-3在癌组织中的高表达与LVD及淋巴结转移呈正相关性〔9，10〕。正常情况下，淋巴管内皮细胞为静止状态，而在外伤、炎症或者肿瘤情况下，淋巴管内皮细胞会迁移至局部组织并在生长因子作用下形成淋巴管〔11〕。癌细胞侵入到淋巴管被认为是基于增强癌细胞的侵袭性或是癌细胞产生消化酶对其基质破坏，产生的VEGF-C可以引起周围淋巴管增生与扩张，同时癌细胞也很容易侵入淋巴管，通过侵袭肿瘤病灶周边原有的淋巴管系统进入淋巴液进而形成淋巴结转移〔12〕。

此外，VEGF-C可能通过多条通路激活淋巴上皮细胞内膜上的受体引起肿瘤细胞淋巴管的增生。此外，笔者认为，肿瘤细胞可能通过旁分泌途径分泌VEGF-C并与淋巴管内皮细胞上相关受体结合，从而使VEGFR-3酪氨酸酶产生磷酸化，导致肿瘤周围淋巴管生成和扩张，增加肿瘤转移扩散的可能性〔13〕。而通过深入研究D2-40，并通过阻断VEGF-C和VEGFR-3信号传导通路表达，有望成为阻断癌细胞经淋巴道转移的重要手段之一。

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2 刘新兰，李亦工，马志兰，等.胃癌组织中VEGF-C、VGFR-3表达和微淋巴管密度的研究〔J〕．宁夏医学杂志，2014;36(5):385-7.

3 Joukov V，Pajusola K，Kaipainen A，et al．A novel vascular en-dothelial growth factor，VEGF-C is a ligand for the Flt4(VEG-FR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases〔J〕．EMBO J，1996;15(2):290-8.

4 白云飞，覃 洁，彭诗东.喉癌组织中Survivin和VEGF的表达及其临床意义〔J〕．中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2012;33(1):5-9.

5 武彦昭，施惠晶，景尚华，等.喉癌组织中VEGF-C及其受体VEGFR-3和D2-40的表达及意义〔J〕．山东医药，2013;53(41):4-7.

6 Ran S，Volk L，Hall K，et al．Lymph angiogenesis and lymphatic metastasis in breast cancer〔J〕．Pathophysiology，2010;17(4):229-51.

7 王 莹，李文媛，贾 桦，等.喉癌组织中VEGF-D表达与淋巴管生成及预后的关系〔J〕．解剖科学进展，2011;17(2):116-20.

8 Hirakawa S，Brown LF，Kodarna S，et al．VEGF-Cinducedlymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor me-tastasis to distant sites〔J〕．Blood，2007;109(3):1010-7.

9 王中亮，陈 尧，李瑞祥.血管内皮生长因子C及其受体VEG-FR23的研究进展〔J〕．肿瘤防治杂志，2002;9(Suppl 5):454.

10 王开昕，王 晶，雷立容，等.非小细胞肺癌组织中VEGF-C表达与淋巴转移的关系〔J〕．中国当代医药，2013;20(26):56-7，59.

11 王海涛，金宏林，王 莹，等.CXCR4和VEGF-C在喉癌中的表达及与淋巴结转移的关系〔J〕．中国老年学杂志，2009;29(3):340-2.

12 李文媛，王景霞，王 莹，等.VEGF-C在喉癌组织中的表达及临床意义〔J〕．牡丹江医学院学报，2009;30(5):4-7.

13 赵海滨，吴国忠，徐桂芳，等.胃癌组织中VEGF-C、VEGF-D、MMP-9的表达变化及意义〔J〕．山东医药，2009;49(50):18-20.