大肠癌中上皮钙黏蛋白、β-catenin和基质金属蛋白酶-9的表达及其临床意义

许 欣 姚冬颖 赵振亚 李永才(邢台市人民医院病理科，河北 邢台 05400)

肿瘤的侵袭、转移仍是大肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤细胞间黏附的丧失是肿瘤浸润、转移的第一步。上皮钙黏蛋白(E-cadherin)在组织结构的形成和维持中发挥重要作用，同时E-cadherin必须与连接素形成复合物才能发挥作用，β-catenin是复合物功能起重要调控作用的因子，任何一种成分表达异常都导致细胞间黏附力下降，造成肿瘤的浸润、转移增加。基质金属蛋白酶(MMP)-9是MMPs中的水解细胞外基质(ECM)重要的蛋白水解酶，与肿瘤的浸润、转移密切相关。本研究检测大肠癌中E-cadherin、β-catenin、MMP-9的表达及其相关性，进一步探讨大肠癌浸润、转移机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取邢台市人民医院病理科2010年1月至2011年12月期间手术切除大肠癌标本110例，术前均未接受任何抗肿瘤治疗。男61例，女49例;年龄＜55岁32例，≥55岁78例;肿物位于结肠70例，位于直肠40例;肿瘤最大直径＜4 cm者48例，＞4 cm者62例;高-中分化66例，低分化44例;浸润深度未侵及浆膜51例，侵及浆膜59例;无淋巴结转移的57例，有淋巴结转移的53例;Dukes分期A+B期50例，C+D期60例。另取20例正常大肠黏膜(来自同期大肠腺癌手术切除距离肿瘤5 cm以上未受累的大肠肠残端组织)作为对照。所有标本均常规取材，10%中性缓冲福尔马林液固定，石蜡包埋。每例选取有代表性的蜡块做3μm厚连续切片，备做HE及免疫组化染色。

1.2 方法 采用免疫组化EnVision两步法，鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、鼠抗人β-catenin单克隆抗体、鼠抗人MMP-9单克隆抗体(均为工作液)及免疫组化试剂盒均购于福州迈新生物技术有限公司。以试剂公司提供的阳性切片作阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阳性对照，二氨基联苯胺(DAB)显色，每例都行HE切片作为对照观察。

1.3 免疫组化结果判定标准 高倍镜下随机计数5个不同视野，每高倍视野计数100个瘤细胞，以阳性瘤细胞占全部瘤细胞的百分比判断。E-cadherin和β-catenin蛋白阳性细胞为细胞膜呈棕黄色染色，阳性细胞数≥10%为阳性(+)，阳性细胞数≤10%为阴性(-)〔1〕。MMP-9阳性表达为细胞质或核呈棕黄色颗粒，阳性细胞数≥10%为阳性(+)，阳性细胞数＜10%为阴性(-)〔2〕。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件行χ2检验和Spearman相关分析。

2 结果

2.1 E-cadherin、β-catenin、MMP-9在大肠癌及对照组的表达E-cadherin和β-catenin正常分布于上皮细胞的细胞膜，染色呈棕黄色，胞质及胞核不表达，而在大肠癌组织中瘤细胞染色与正常上皮细胞相似，表达降低，有时可见胞质染色。E-cadherin和β-catenin在20例正常大肠黏膜上皮均呈强表达，阳性率为100%，而在大肠癌中阳性率为67.3%和62.7%，有显著差异(P＜0.05)。MMP-9阳性表达定位于细胞质，表现为棕黄色颗粒，在20例正常大肠黏膜中仅有3例呈阳性表达，阳性率仅为15%，明显低于结直肠癌(57.3%，P＜0.05)。见图1。

2.2 大肠癌中E-cadherin、β-catenin、MMP-9的表达及其与临床病理指标的关系 E-cadherin、β-catenin的表达与组织学分级、浆膜侵犯、淋巴结转移、临床分期呈负相关;MMP-9的表达与浆膜侵犯、淋巴结转移、临床分期呈正相关。见表1。

2.3 大肠癌中 E-cadherin、β-catenin、MMP-9表达的相关性E-cadherin阳性表达的74例中，MMP-9阴性表达者有37例，而MMP-9阳性表达63例中，E-cadherin阴性表达者有26例，E-cadherin和MMP-9蛋白表达呈负相关趋势(r=-0.211，P=0.027)。β-catenin阳性表达的69例中，MMP-9阴性表达者有36例，而MMP-9阳性表达63例中，β-catenin阴性表达者有33例，β-catenin和MMP-9蛋白表达呈负相关趋势(r=-0.223，P=0.019)。

图1 E-cadherin、β-catenin及MMP-9在中分化大肠癌组织中的表达(DAB，×400)

表1 E-cadherin、β-catenin、MMP-9 蛋白阳性表达与大肠癌临床病理参数的关系(n)

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移是一个包含复杂步骤的过程，癌细胞需经历从原发灶脱落、细胞黏附于基质、蛋白水解酶降解基质等向周围组织侵袭或进入淋巴系统而进一步向远处转移。E-cadherin即E-钙黏附分子是钙依赖黏附素家族中的重要成员之一，广泛分布于上皮细胞相连接的细胞膜上，它介导并维持上皮细胞之间的紧密连接及正常的细胞形态。E-cadherin与βcatenin形成介导同型细胞间黏附的E-cadherin/β-catenin复合体，在维持细胞极性和组织结构完整性中起重要作用。β-catenin是环连蛋白重要成员，为一条由多肽链组成的蛋白质，它还参与Wnt信号通路，介导信号从胞膜至胞核的传递〔3〕。已有研究发现的E-cadherin和β-catenin的低表达与多种恶性肿瘤的浸润和转移有关。Aresu等〔4〕报道，E-cadherin和 β-catenin的低表达与大肠癌的组织学分级、临床分期密切相关，表明E-cadherin和β-catenin表达的降低至使其介导的瘤细胞间黏附功能下降，肿瘤细胞趋于离散，易于从原发部位脱落，侵犯到邻近的组织，而后出现远处转移。本研究结果显示，E-cadherin与β-catenin在癌组织中的阳性表达显著低于正常组织，且其表达水平随肿瘤分化的降低、浸润深度的增加、淋巴结转移的发生及临床分期的进展明显降低，提示大肠癌的发生发展和浸润转移与E-cadherin和β-catenin表达的降低关系密切。

MMPs家族是一类依赖于锌离子的内切蛋白水解酶，能降解细胞外基质成分，促进肿瘤侵袭和转移，还可通过新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散〔5〕。MMP-9是MMPs家族中的重要成员，又名明胶酶B，属于Ⅳ型胶原酶，能降价天然的Ⅳ/Ⅴ胶原和明胶，与多种恶性肿瘤有着密切的联系，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中发挥重要作用〔6〕。Zhang等〔7〕研究发现，MMP-9在低分化和远处转移的病例中高表达。Bendardaf等〔8〕的研究也证实，MMP-9表达水平低的患者预后更好。本研究结果显示，MMP-9在大肠癌组织中的阳性表达率显著高于对照组正常黏膜，提示其参与了大肠癌的发生。进一步研究与临床病理参数的关系发现，MMP-9的表达与临床分期、浆膜浸润、淋巴结转移呈正相关，说明其与大肠癌浸润和转移过程有关。

E-cadherin、β-catenin和MMP-9在大肠癌浸润和转移中的相互关系尚不清楚。本研究相关分析发现，大肠癌中E-cadherin和MMP-9、β-catenin和 MMP-9的表达均呈负相关，推测MMP-9的高表达抑制了E-cadherin和β-catenin的表达，降低了癌细胞相互间的黏附，促进了癌细胞的浸润和转移。所以E-cadherin和β-catenin的低表达与MMP-9的高表达在大肠癌的发生和恶性生物学行为中关系密切。

综上，本研究证实了 E-cadherin、β-catenin和 MMP-9在大肠癌的发生、浸润和转移中发挥作用。因此，联合检测E-cadherin、β-catenin和MMP-9在大肠癌中的表达情况，对预测的生物学行为，指导临床有重要意义，可为基因治疗提供新的靶点。

1 Banu YÖ，Didem K，Fevziye K，et al.Immunohistochemical study of E-cadherin and β-catenin expression in colorectal carcinomas〔J〕.Pol J Pathol，2011;62(1):19-24.

2 刘 刚，关英华，任晓强，等.输尿管癌中MMP-9、uPA的表达及与预后的关系〔J〕.临床与实验病理学杂志，2012;28(10):1086-90.

3 Keiyu Z，Guangtao W，Yirong W，et al.The potential involvemet of E-cadherin and β-catenin in Meningioma〔J〕.PLos One，2010;5(6):1-6.

4 Aresu L，Pregel P，Zanetti R，et al.E-cadherin and β-catenin expression in canine colorectal adenocarcinoma〔J〕.Res Vet Sci，2010;89(3):409-14.

5 Nutt JE，Durkan GC，Mellon JK，et al.Matrix metalloproteinases(MMPs)in bladder cancer:the induction of MMP9 by epidermal growth factor and its detection in urine〔J〕.BJU Int，2003;91(1):99-104.

6 李晓虹，吴秋婉，张志明.ECM1、MMP-9与胃癌的研究新进展〔J〕.医学综述，2011;17(19):2923-5.

7 Zhang Y，Guan XY，Dong B，et al.Expression of MMP-9 and WAVE3 in colorectal cancer and its relationship to clinicopathological features〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2012;138(12):2035-44.

8 Bendardaf R，Buhmeida A，Hilska M，et al.MMP-9(gelatinase B)expression is associated with disease-free survival and disease-specific survival in colorectal cancer patients〔J〕.Cancer Invest，2010;28(1):38-43.