RNA 干扰Bax对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用

张永胜

急性心肌梗死是临床常见的心脑血管疾病之一，其发病率、致死率和致残率高，已经成为严重影响人类健康的公共疾病之一［1，2］。目前研究显示心肌梗死产生的氧化应激、负荷过重、缺血、缺氧、再灌损伤等可诱导心肌细胞凋亡，因此如何有效地抑制心肌细胞凋亡，对缓解和治疗急性心肌梗死具有重要的意义［3］。Bax是Bcl－2家族中研究最为广泛的促凋亡蛋白，其主要表达于细胞质中，可形成同源二聚体或者与Bcl－2 形成异源二聚体而介导细胞凋亡［4，5］。近年来研究显示在急性梗死心肌组织中Bax 蛋白的表达量明显升高，提示其可能参与了急性心肌梗死心肌细胞的凋亡，加重了心肌功能的损伤［6］。RNA 干扰技术是近年来发展起来的基因操作技术，其可特异性的沉默相关基因的表达，对调节细胞生物学功能具有重要的意义［7］。本研究探讨了RNA 干扰技术沉默Bax 基因对急性心肌梗死大鼠心肌组织的保护作用，旨在为临床治疗急性心肌梗死提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD 大鼠（180g～200g）购自上海莱斯克动物有限公司；Bax一抗购自美国Abcam 公司；HRP－羊抗鼠二抗购自santa cruz公司；脂质体和Triozol购自Invitrogen公司；SYBR Green通用型qPCR Master Mix 购 自 罗 氏 生 物；Real－time PCR 扩 增 仪 购自Applied Biosystems；逆转率试剂盒购自TAKARA公司；经修饰的Bax－siRNA 由吉玛生物合成；；TUNNEL试剂盒购自罗氏生物；TTC 染液购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2 急性心肌梗死大鼠模型构建及治疗 45只大鼠随机分为假手术组、心梗组和Bax干扰组。所有大鼠采用10%的水合氯醛麻醉，固定大鼠并打开胸腔，假手术组不做左冠状动脉前降支结扎。心梗组和Bax干扰组大鼠开胸后行左冠状动脉前降支结扎术。模型构建成功标志为：大鼠左心室前壁苍白，多导生理记录仪显示大鼠心电标准Ⅱ导联，ST 段抬高和（或）T 波抬高。手术结束后所有大鼠关闭胸腔，手术切口注射青霉素抗感染。假手术组和心梗组在术前12h心肌组织内注射100μL脂质体，Bax干扰组大鼠术前心肌注射脂质体与Bax siRNA 的混合物100μL。术后72h处死大鼠，取心肌组织进行指标分析。

1.3 大鼠心肌组织Bax mRNA 表达水平变化 大鼠心肌组织0.1g 加入1 mL riozol中匀浆，然后加入2 0 0μL三氯甲烷振荡混匀，冰上静置分层，1 2 0 0 0 r／min离心15min，上清加入等体积的异丙醇中，冰上放置30min使RNA 沉淀，然后12 000r／min离心15 min，弃上清，沉淀部分用预冷的75%乙醇溶液洗涤2次，8 000r／min离心10min，沉淀用DEPC 水处理的双蒸水溶液中。分光光度仪测量RNA 浓度采用TAKARA 逆转录试剂转录成cDNA。

设计大鼠Bax的PCR 引物，引物序列如下：Bax－F：5′－GGCGATGAACTGGACAAC－3′；Bax－R：5′－CCGAAGTAGGAAAGGAGGC－3′。引物由上海英俊生物公司合成。对引物特异性和退火温度进行优化。然后按照下述反应体系制备反应混合物：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL，上游／下游引物各（10μmmol／L）各1μL，cDNA 1μL，补双蒸水至终体积为20μL。根据检测样本的数量配制相应的体积，对应加入PCR 板中，每孔20μL。1 500r／min离心将反应混合物甩至管底，根据下列反应条件进行PCR：预变性：95 ℃，30s；变性：95 ℃，3s；退火延伸：60 ℃，30s；构建溶解曲线。最后从实时荧光定量PCR 仪上直接读取数据。

1.4 大鼠心肌组织Bax蛋白质表达水平变化 大鼠心肌组织取出后用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，经抗原修复后，切片用3%过氧化氢－甲醇液室温处理20 min，清除内源性的过氧化氢酶，PBST 洗涤3次，每次5min。用10%山羊血清37℃封闭30min，然后滴加一抗工作液4 ℃孵育过夜；次日37 ℃回温30min后用PBST 洗涤3次，每次5min；在切片上滴加二抗工作液37℃孵育30 min，然后PBST 洗涤3 次，每次5 min；DAB 显色，苏木精复染，盐酸酒精返蓝。然后梯度脱水，中性胶封片。评定方法：每张切片随机选取10个视野，放大400 倍，采用Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统对免疫组化进行半定量分析。

1.5 大鼠心肌组织梗死范围分析 大鼠心肌组织切成厚度2mm 的薄片，置于1%的TTC 磷酸缓冲液中37 ℃染色20min。理论上正常组织应该为红色，梗死组织为白色。然后再显微镜下将梗死组织与正常心肌组织分开，用分析天平称取正常组织和梗死组织的湿重，梗死范围为梗死组织重量占左心室总质量的百分数。

1.6 大鼠心肌细胞凋亡指数 心肌组织切片经抗原修复脱蜡后，PBST 洗涤3次，每次5min。此后步骤严格按照TUNEL试剂盒操作说明进行操作。观察时标本放大400倍，随机选取梗死区和周边区域10个视野，计算凋亡细胞占总细胞的比例作为心肌细胞的凋亡指数。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多组计量资料采用方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠心肌组织Bax mRNA 和蛋白质水平变化（见图1） 与假手术组比较，心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平明显升高（P＜0.05）。Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平较心梗组明显下降（P＜0.05）。

图1 各组大鼠心肌组织中Bax mRNA 和蛋白质水平

2.2 大鼠心肌组织梗死范围比较（见图2） 采用TTC染色法分析了大鼠心肌梗死模型不同处理后大鼠心肌组织梗死范围变化，心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较假手术组明显增加（P＜0.05）。而Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较心梗组明显下降（P＜0.05）。

图2 各组大鼠心肌组织梗死范围比较

2.3 大鼠心肌细胞凋亡指数比较 大鼠心肌细胞的凋亡主要存在于梗死边缘，而远离梗死区细胞凋亡水平较低。假手术组大鼠心肌凋亡指数仅为（3.54±1.02）%，而心梗组和Bax干扰组大鼠心肌细胞的凋亡指数分别为（51.32±7.02）%和（20.45±6.77）%。心梗组和Bax干扰组心肌细胞凋亡指数明显高于假手术组（P＜0.05）。Bax干扰组大鼠心肌细胞凋亡指数明显低于心梗阻（P＜0.05）。

3 讨 论

急性心肌梗死发生后除了心肌坏死外，心肌细胞凋亡也是急性心肌梗死后心肌发生的另一重要的生物学过程，急性心肌梗死后心肌细胞凋亡主要位于缺血坏死边缘，而远离梗死区心肌细胞凋亡较少［8］。这一结果与本研究相一致。心肌细胞凋亡可导致心肌细胞的大量丢失，进一步增加心肌损伤，促进了疾病的发展。因此有效的降低心肌细胞凋亡对降低急性心肌梗死患者疾病进展，争取更多的治疗时间有着重要的意义。细胞凋亡是一个高度调控的过程，此过程受到诸多的细胞因子和调节蛋白的参与，其中Bax蛋白是细胞凋亡途径中重要的分子。Bax蛋白是Bcl－2家族成员之一，其与Bcl－2 的比例直接决定着细胞的命运。近年来，临床研究显示在急性心肌梗死后数小时内，心肌组织中的Bcl－2表达量会有一定程度的增加，其可抑制心肌细胞的凋亡，起到保护心脏的作用，但是这种高表达只能短暂的，在疾病进展数小时后，心肌细胞中Bcl－2蛋白很快消失，继而出现Bax 蛋白的高表达，Bax蛋白高表达使细胞命运趋于凋亡，其可通过与Bcl－2形成异源二聚体或者自身形成同源二聚体，介导细胞的凋亡，在急性心肌梗死组织中则而表现出心肌细胞大范围凋亡［9，10］。因此有效的预防急性心肌梗死患者心肌组织中Bax蛋白的高水平表达可能对急性心肌梗死患者心肌组织具有一定的保护作用。RNA 干扰技术是利用双链RNA 高效、特异性降解细胞内同源信使RNA，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型方法［11，12］。

本研究采用RNA 干扰技术沉默了急性心肌梗死大鼠心肌组织中的Bax，分析其在急性心肌梗死大鼠心肌保护中的作用。

本研究设计的并经特殊修饰的Bax siRNA 可在体内起到抑制Bax表达的作用，结果显示，在经Bax siRNA 处理后大鼠心肌组织中Bax mRNA 和蛋白质水平较心梗组明显下降。实验进一步分析了Bax沉默对急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围的影响，显示经Bax siRNA 处理的大鼠心肌梗死范围较心梗组大鼠明显下降，但是仍然高于假手术组，提示Bax沉默可降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围，起到保护心肌功能的作用。在心肌细胞凋亡方面，Bax siRNA 明显降低了急性心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡，与心梗组比较具有统计学意义。Bax基因沉默可显著降低急性心肌梗死大鼠心肌组织的梗死范围，同时降低心肌细胞的凋亡指数，对心脏功能具有一定的保护作用。

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