MMP-2和MMP-9在新疆哈萨克族食管癌中的表达及意义

孙晓宏，蒋威华，李卉，尹娜，李惠武(新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科;基础医学院科研中心，乌鲁木齐8300)

MMP-2和MMP-9在新疆哈萨克族食管癌中的表达及意义

孙晓宏1，蒋威华1，李卉2，尹娜2，李惠武2
(新疆医科大学1附属肿瘤医院胸外科;基础医学院科研中心，乌鲁木齐830011)

目的探讨MMP-2和MMP-9 mRNA在新疆哈萨克族食管鳞癌及其癌旁组织中的表达及二者的相关性。方法选取食管癌手术离体标本40例，每例各取癌组织和对应的癌旁组织一份，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR法)检测MMP-2和MMP-9mRNA在癌及癌旁组织组中的表达。运用Western-blot法检测MMP-2和MMP-9在癌及癌旁组织组中的蛋白表达。采用Pearson相关分析法分析MMP-2和MMP-9mRNA在癌组织中表达的相关性。结果MMP-2mRNA在癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为95.0%(38/40)和77.5%(31/40)，差异有统计学意义(χ2=5.165，P=0.023);MMP-9mRNA在癌组织和癌旁组织中的阳性率分别为62.5%(25/40)和10.0%(4/40)，差异有统计学意义(χ2=23.854，P=0.000)。MMP-2mRNA的表达与食管鳞癌浸润深度有关联(χ2=5.260，P=0.022)，与食管鳞癌淋巴结转移无关联(χ2=0.088，P=0.767)。MMP-9mRNA的表达与食管鳞癌浸润深度有关(χ2=4.365，P=0.037)，与食管鳞癌淋巴结转移无关联(χ2=0.156，P=0.693)。MMP-2 mRNA与MMP-9 mRNA在食管鳞癌组织中的表达呈正相关关系(r=0.327，P=0.039)。结论MMP-2和MMP-9可能参与了新疆哈萨克族食管鳞状细胞癌的肿瘤发生发展，但在淋巴结转移方面可能不发挥关键作用。

食管鳞状细胞癌;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-9;逆转录-聚合酶链式反应

食管癌是全球位列第8的恶性肿瘤，在全球癌症死亡原因中位列第6。2008年全球有482 300人被诊断患有食管癌，有406 800人死于食管癌［1］。2003-2007年我国食管癌发病率为19.24/10万，在癌症发病构成中排列第6位，同期食管癌死亡率为15.39/10万，在癌症死亡原因中列第4位［2］。中国食管癌发病占全球的53.8%，死亡占全球的51.9%［3］。肿瘤细胞的转移与细胞外基质(extra cellularmatrix，ECM)的降解密切相关［4］。ECM由多种蛋白裂解酶降解，其中就包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。国外鲜有关于MMP与食管癌发生发展关系的研究，国内对于MMP的研究多采用免疫组织化学法，且多是单独针对MMP中某一单一基因的研究，本研究应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测MMP-2和MMP-9基因在食管癌组织及其相应的癌旁组织中的表达情况，同时运用Western-blot技术在蛋白水平予以验证，在基因转录水平和蛋白表达水平探讨两者在食管癌发生发展和转移中的作用，同时探讨两者之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2009年12月-2011年9月在新疆医科大学附属肿瘤医院行根治性切除的新疆哈萨克族手术标本40例，每例标本分别取癌组织及其相应癌旁组织各一份，液氮冷冻后-80℃冰箱储存留待检测。40例均为经病理证实的食管鳞状细胞癌，男性72例，女性28例。年龄最小37岁，最大80岁，中位年龄57.4岁。根据食管癌TNM2009第7版分期标准，T1+T2期16例，T3+T4期24例。有淋巴结转移16例，无淋巴结转移24例。高、中分化和低分化的分别有29和11例。

1.2 主要试剂和设备实验所用Trizol试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒分别购自Invitrogen公司、Promega公司和上海生物工程有限公司;其他实验试剂，如溴化乙锭(EB)、琼脂糖、氯仿、无水乙醇、异戊醇和异丙醇等由新疆医科大学基础医学院科研中心提供。PCR扩增仪为美国Bio-Rad公司的生产的Icycler型，DC2000凝胶成像分析仪也来自美国Bio-Rad公司。

1.3 提取组织标本中的总RNA的及浓度检测按照Trizol试剂盒的操纵规程提取组织标本总RNA，于紫外分光光度计下分别测定1μg所提RNA在260和280 nm处的吸光度(A)A260和A280值，计算A260/A280值，使其在1.8～2.1之间以保证所提取的RNA的浓度和纯度。取5μL的RNA于1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析仪观察提取RNA的18S和28S条带，确保所提RNA的质量。

1.4 合成互补DNA(cDNA)在1μL总RNA标本中分别加1μL引物和9μL双蒸水，将其混匀后72℃恒温温浴10 min后取出，将混合液置于冰上，依次加2μL dNTP、4μL MgCl2、0.5μLRNA酶抑制剂、2μL10倍缓冲液和0.5μL逆转录酶于其中后混匀，42℃恒温1 h，95℃恒温5 min，然后取出并放置在冰上，再加入80μL双蒸水于其内使最终逆转录产物体积为100μL。

1.5 配制PCR反应体系及PCR反应向6μL双蒸水中依次加入目的基因正、反向引物各1μL和2倍浓度的PCR试剂盒反应液10μL，再加2μL已合成的cDNA加入其中，使PCR反应体系终体积为20 μL。各基因引物序列、产物大小及PCR反应Tm值见表1。

表1 GAPDH、MMP-2和MMP-9的引物序列和PCR反应条件

1.6 判定PCR扩增产物于5μLPCR反应产物内加入1μL缓冲液(buffer)后将其在2%琼脂糖凝胶上电泳，在DC2000凝胶成像分析仪下观察目的基因条带并保存成像图像。在499 bp附近出现亮色条带，则MMP-2表达阳性，否则为阴性;在308 bp附近出现亮色条带，则MMP-9表达阳性，否则为阴性。

1.7 统计学处理采用统计软件SPSS 16.0进行统计分析，比较MMP-2和MMP-9在癌组织和癌旁组织中阳性表达的差异，分析MMP-2和MMP-9在癌组织组中的相关性。

2 结果

2.1 40例癌组织与癌旁组织MMP-2mRNA、MMP-9m RNA表达比较40例标本中MMP-2mRNA在癌组织中阳性表达为95.0%(38/40)，在对应癌旁正常组织中的阳性表达为77.5%(31/40)，两者比较差别有统计学意义(χ2=5.165，P= 0.023)，MMP-2mRNA在癌组织中的表达较其在癌旁正常组织中的表达高;MMP-9mRNA在癌组织中阳性表达为62.5%(25/40)，在对应癌旁正常组织中的阳性表达为10.0%(4/40)，两者比较差别有统计学意义(χ2=23.854，P=0.000)，MMP-9mRNA在癌组织中的表达较其在癌旁正常组织中的表达高，见图1。

图1 MMP-2m RNA、MMP-9m RNA及GAPDHm RNA基因PCR电泳图

2.2 食管癌组织中MMP-2和MMP-9m RNA的表达与食管鳞状细胞癌临床病理因素的关联MMP-2和MMP-9mRNA的表达与肿瘤浸润深度有关联，与肿瘤淋巴结转移、患者的性别、年龄和肿瘤分化程度均无关联(P＞0.05)，见表2。

表2 MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表达与临床病理资料之间的关系

2.3 食管癌组织中MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表达经Pearson相关分析结果显示，MMP-2mRNA与MMP-9mRNA呈正相关(r=0.274，P=0.006)，结果见表3。

表3 MMP-2mRNA和MMP-9mRNA在40例哈萨克族食管鳞状细胞癌中表达的相关性

3 讨论

MMPs是一类能够降解ECM和基底膜组分的蛋白水解酶，其家族成员目前发现已超过20个，蛋白水平根据各自降解底物的特异性和自身结构的不同分为胶原酶、间质溶解素和明胶酶。关于MMP-2在各种肿瘤组织及正常组织内的表达情况有多位学者进行了研究，因所采用的研究方法不同，所以其研究结果不尽相同，甚至有些结果是截然相反的。李秀梅等［4］采用RT-PCR法对食管癌中MMP-2的表达进行了检测，结果发现:MMP-2在食管癌组织中的表达较正常组织增高，差异均具有统计学意义。多位学者采用免疫组化法对食管癌中MMP-2的表达进行了检测，结果发现:MMP-2蛋白在食管癌中表达明显高于癌旁正常组织［5-8］。本研究结果显示:MMP-2 mRNA的表达在癌组织中均明显高于癌旁正常组织，并且MMP-2 mRNA的表达与肿瘤侵润深度有关联。本研究结果与上述研究结果一致，故认为MMP-2在食管癌发生和浸润性生长过程中发挥了重要作用。Hong等［9］和Koskensalo等［10］应用免疫组化法对结直肠癌中MMP-2的表达进行了研究，结果发现MMP-2与结直肠癌的淋巴结转移无关。Hwang等［11］应用免疫组化法对胃癌中MMP-2的表达进行了研究，结果发现MMP-2与肿瘤淋巴结转移无关。董绍安等［12］和于维娜［13］应用免疫组化法对食管癌中MMP-2的表达进行了研究，结果发现MMP-2蛋白表达与淋巴结转移无关;本研究结果显示:MMP-2的表达与肿瘤淋巴结转移无关联，与上述研究结果一致，故认为MMP-2在食管癌淋巴结转移方面不发挥关键作用。

近年研究显示:MMPs在多种肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤浸润有关联，如在胃癌的研究中发现:MMP-9在癌组织中的表达高于癌旁正常胃黏膜组织，且MMP-9的表达与胃癌浸润深度有关［14-15］; Chen等［16］对食管癌的研究表明，PLGF促进食管癌的转移是通过对MMP-9的激活实现的。Li等［17］研究发现，环孢菌素A/MMP-9信号通路有助于食管癌细胞的恶性转变。有关食管癌的研究也发现: MMP-9在癌组织中的表达高于癌旁正常组织，且其表达与食管癌浸润深度有关联［18］。本研究结果显示:MMP-9 mRNA表达在癌组织中均明显高于癌旁正常组织，并且其表达与肿瘤浸润深度有关联。本研究结果与上述各研究结论一致，故认为MMP-9在食管癌发生及浸润性生长过程中发挥了重要作用。Koskensalo等［19］应用免疫组化法对结直肠癌的研究发现:MMP-9的表达与肿瘤淋巴结转移无关联。Durlik等［20］应用免疫组织化学法对胰腺癌的研究发现:MMP-9的表达与淋巴结转移无关联。Oshima等［21］应用RT-PCR法对结直肠癌的研究发现: MMP-9与肿瘤淋巴结转移无关联。Lu等［22］应用免疫组织化学法对食管癌的研究发现:MMP-9与淋巴结转移无关联。本研究结果显示:MMP-9的表达与肿瘤淋巴结转移无关联，结果与上述研究结果一致，故认为MMP-9在食管癌淋巴结转移方面不发挥关键作用。

本研究结果显示:MMP-2与MMP-9 mRNA之间呈正相关关系，说明MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达之间起着相互促进的作用，可能相互协同促进新疆哈萨克族食管癌的发生及进展。

综上所述，食管癌的发生发展不是个单一基因控制的反应过程，本研究结果显示:MMP-2和MMP-9可能促进了食管鳞状细胞癌的发生，同时可能增强了食管鳞状细胞癌的浸润生长能力。MMP-2和MMP-9与食管癌的淋巴结转移可能均无关联。MMP-2和MMP-9表达水平的上调可能是食管癌发病的机制之一，对MMP-2和MMP-9的联合检测可评价新疆哈萨克族食管鳞状细胞癌的浸润生长程度，并为进一步阐明其发生发展和转移提供了实验依据。

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Expression and significance of MMP-2and MMP-9 in Kazakh patients with esophageal squamous cell carcinoma in Xinjiang

SUN Xiaohong1，JIANG W eihua1，LIHui2，YIN Na2，LIHuiwu2
(1Surgical Department of Thorax，Affiliated Tumor Hospital;2Research Center of Basis Academy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Ob jective To study the expression and correlation of MMP-2 and MMP-9 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues of Kazakh patients in Xinjiang.Methods 40 histopathologicallyconfirmed esophageal cancer and an equal number of corresponding adjacent tissue biopsieswere analyzed for the expression ofMMP-2 and MMP-9mRNA in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissueswith RT-PCR method.Western-blotwas used to detect the expression of protein ofMMP-9 and MMP-2 in the cancer tissues and corresponding adjacent tissues.The Pearson correlation analysiswas used to analyze the correlation between MMP-9 and mRNA MMP-2 expression in cancer tissues.Results Positive rates of MMP-2mRNA expression in cancer tissues and corresponding adjacent tissueswere 95.0%(38/40)and 77.5%(31/40)respectively，and the differencewas statistically significant(χ2=5.165，P=0.023);Positive rates of MMP-9 mRNA in cancer tissues and corresponding adjacent tissueswere 62.5%(25/40)and 10.0%(4/40)，which was also statistically significant(χ2= 23.854，P=0.000).The expression ofMMP-2mRNA was correlated with the depth of invasion ofesophageal squamous cell carcinoma(χ2=5.260，P=0.022)but had no association with the lymph nodemetastasis of esophageal squamous cell carcinoma(χ2=0.088，P=0.767).The expression of MMP-9 mRNA was correlated with the depth of invasion of esophageal squamous cell carcinoma(χ2=4.365，P=0.037)，but there was no association with lymph node metastasis(χ2=0.156，P=0.693).The expression of mRNA MMP-9 and mRNA MMP-2 in esophageal squamous cell carcinoma was positively correlated(r=0.327，P=0.039).Conclusion MMP-2 and MMP-9 may be involved in the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma in Kazakh patients butmay not play a key role in the lymph nodemetastasis.

esophageal squamous cell carcinoma;matrixmetalloproteinase-2;matrixmetalloproteinase-9;reverse transcription-polymerase chain reaction

R735.1

A

1009-5551(2015)06-0691-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.008

2014-11-13］

(本文编辑张巧莲)

国家自然科学基金(81350021)

孙晓宏(1974-)，男，博士，副主任医师，研究方向:胸部肿瘤外科诊治。

李惠武，男，教授，博士生导师，研究方向:食管癌基础研究，E-mail:huiwuli1234@163.com。