五味甘露药浴散加减方对佐剂型关节炎大鼠血清RF和滑膜组织JNK1的影响

韦 婷，刘 宇，王天虹，吴嘉思，张 艺，曾 勇

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

五味甘露药浴散加减方对佐剂型关节炎大鼠血清RF和滑膜组织JNK1的影响

韦 婷，刘 宇，王天虹，吴嘉思，张 艺，曾 勇

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

观察五味甘露药浴散加减方对佐剂型关节炎大鼠的疗效及对大鼠血清RF和踝关节滑膜组织JNK1的的影响.采用弗氏完全佐剂关节炎(Adjuvant Arthritis Rats，AA)大鼠模型，用大鼠致炎侧足跖肿胀率评价五味甘露药浴散加减方对AA大鼠的治疗效果，ELISA法测定血清中RF的水平，免疫组化法测定踝关节滑膜组织蛋白激酶JNK1的表达.实验结果表明，与模型组比较，给药四周，五味甘露药浴散加减方高剂量能有效减少致炎侧足跖肿胀率(P＜0.05);给药两周和四周，五味甘露药浴散加减方高剂量能明显降低血清中RF的水平(P＜0.05).五味甘露药浴散加减方各剂量均能显著降低踝关节滑膜组织JNK1的表达(P＜0.05或P＜0.01).五味甘露药浴散加减方能有效的减小佐剂性关节炎大鼠致炎侧足跖肿胀率，其作用机制可能与其降低血清中RF的水平和滑膜组织JNK1的表达有关.

五味甘露药浴散加减方;佐剂型关节炎;肿胀率;RF;JNK1

藏药浴疗法是藏医治疗风湿、类风湿性关节炎的 常用手段［1］.“五味甘露”方是藏药浴的基础配方，最早记载于藏医经典巨著《四部医典》［2-3］.临床多采用五味甘露药浴散基本方加减进行治疗.藏医理论认为的关节肿痛、四肢僵直、肌肉萎缩等“黄水”性疾病，属于藏医学中“真布”范畴，藏药浴治疗“真布”历史悠久［4］.该病与现代医学认为的风湿性关节炎类似.但目前缺少五味甘 露药浴散对类风湿关节炎的相关药效机制报道，因此，本研究拟在藏医药理论的指导下，建立佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠模型，测定给药两周及给药四周AA大鼠致炎侧足跖肿胀率和血清RF的水平，踝关节滑膜组织蛋白激酶JNK1的表达，初步探讨五味甘露药浴散加减方防治类风湿关节炎的作用机制.

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠(SPF级)，体重200±20 g，成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号:SCXK(川)2013-24.

1.2 实验药品、试剂

五味甘露药浴散加减方，由西藏藏医学院制备，方药组成:刺柏叶500 g，水柏叶500 g，麻黄500 g，大籽蒿500 g，青稞100 g，峨参10 g，喜马拉雅紫茉莉10 g，蒺藜 10 g，黄精 10 g，乳香10 g，天门冬 10g，决明子10 g，黄葵子 10 g，碱花 10 g，甘松 10 g，岩精 10 g，寒水石10 g，黄硫磺10 g.

醋酸地塞米松:规格0.75mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字 H33020822，产品批号:130123

完全弗氏佐剂(Freund＇s Adjuvant Complete)，Sigma 公司，批号:(#SLBF 9338V)，规格:1 mg.mL-1灭活结核杆菌;卡介苗冻干粉，上海瑞楚生物科技有限公司，批号:201409，规格:60mg/支.完全弗氏佐剂中再次加入一定剂量灭活的卡介菌，制备成10 mg.mL-1灭活结核杆菌的完全弗氏佐剂，4℃冷藏保存备用.

RF ELISA试剂盒:批号 YAD 2015043002，购置于北京雅安达生物技术有限公司.一抗:JNK1抗体，兔多克隆抗体，批号:ab199380，德国默克集团--密理博中国有限公司;二抗:生物素化山羊抗兔IgG(H+L)，批号:13152A11;三抗:辣根酶标记链霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批号:13152A11.二抗，三抗均购置于北京中衫金桥生物有限公司;

1.3 仪器

足趾容积测量仪，泰盟PV-200，成都泰盟科技有限公司;转轮式切片机，2015型，德国徕卡(Leica)仪器有限公司;全自动封闭式组织脱水机，TSJ-Ⅱ型，常州市中威电子仪器有限公司;病理组织漂烘仪，PHY-Ⅲ型，常州市中威医疗仪器有限公司;Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，美国 Media Cybernetics公司;VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪，美国Thermo公司.

2 方法

2.1 造模分组给药

SD健康大鼠60只，适应性饲养3 d后，随机选取10只作为正常对照组，其余50只于大鼠右后足跖皮内注射0.1mL(次.只)-1弗氏完全佐剂致炎，正常对照组在右侧后肢足跖皮下注射0.1 mL生理盐水，用足趾容积测量仪测量致炎前大鼠右后足足容积(mL)2次，取其平均值作为致炎前正常足容积作为基础值.16 d后大鼠继发性关节炎症状出现，成功诱发AA大鼠模型.将AA大鼠随机分为模型组，地塞米松组，五味甘露药浴散加减方高剂量组(104.00 g.L-1)、中剂量组(52.00 g.L-1)、低剂量组(26.00 g.L-1).

五味甘露药浴散加减方高、中、低剂量组每天药浴1次，每次30 min，温度控制在40℃.模型组和正常组每天同体积温水浴，条件同药浴组，地塞米松组每天(0.150 mg.kg-1)灌胃1次，连续给药4周.

2.2 指标测定

2.2.1 足跖肿胀率

给药2周及4周，测定致炎侧足容积，计算出足跖肿胀率［5］.足跖肿胀率=(致炎后足容积平均值-致炎前足容积的平均值)/致炎前足容积的平均值×100%.

2.2.2 血清RF测定

给药第2周，大鼠后眼眶静脉取血1.5mL，分离血清，采用ELISA法，按照试剂盒说明书，测定大鼠血清中细胞因子RF水平.

给药4周，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛3mLkg-1麻醉，然后从腹主动脉取血2 mL，分离血清，采用ELISA法，按照试剂盒说明书，测定血清中细胞因子RF水平.

2.2.3 免疫组化法测定大鼠踝关节炎滑膜组织JNK1的表达

给药4周，大鼠麻醉取血处死，剪下致炎侧足踝关节，用10%甲醛固定，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，采用S-P(streptavidin-perosidase)免疫组化法，一抗稀释比为1∶200，显色后中性树胶封片.

2.3 统计方法

应用SPSS19.0统计软件进行数据处理分析，所有指标结果均以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析比较组间差异.

3 实验结果

3.1 致炎侧足跖肿胀率结果

与模型组比较，地塞米松组给药2周和4周致炎侧足跖肿胀率显著减小(P＜0.01)，五味甘露药浴散加减方高剂量组给药4周足跖肿胀率明显减小(P＜0.05).如表1.

表1 给药2、4周各组大鼠致炎侧足跖肿胀率比较(±s，n=10，%)Table 1 Comparisons of Joint swelling rate with acute inflammation for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，%)

表1 给药2、4周各组大鼠致炎侧足跖肿胀率比较(±s，n=10，%)Table 1 Comparisons of Joint swelling rate with acute inflammation for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，%)

注:与模型组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量 给药2周 给药4周＊＊模型对照 - 54.621±11.650 48.172±9.381地塞米松 0.150mg.kg-1 29.302±14.830＊＊ 37.674±9.637＊＊五味甘露药浴散加减方 26.00g.L-1 52.917±14.428 43.575±7.479 52.00g.L-1 52.297±14.428 43.206±17.839 104.00g.L-1 50.064±8.877 40.910±8.963*正常对照 - 0.023±6.945＊＊ 5.576±4.054

3.2 血清RF测定

给药2、4周，与正常组比较，模型组大鼠血清RF含量显著升高(P＜0.05)，与模型组比较，地塞米松组、五味甘露药浴散加减方高剂量组大鼠血清RF含量明显降低(P＜0.05).如表2.

表2 给药2、4周各组大鼠血清RF水平比较(±s，n=10，nmol/L)Table 2 Comparisons of serum RF of rat for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，nmol/L)

表2 给药2、4周各组大鼠血清RF水平比较(±s，n=10，nmol/L)Table 2 Comparisons of serum RF of rat for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，nmol/L)

注:与模型组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量 给药2周 给药4周正常对照 - 126.168±33.266* 149.320±45.407*模型对照 - 157.814±19.870 190.334±28.533地塞米松 0.150mg.kg-1 129.748±28.059* 150.368±37.946*五味甘露药浴散加减方 26.00g.L-1 150.683±44.811 183.658±35.262 52.00g.L-1 166.548±53.856 172.811±34.238 104.00g.L-1 122.719±43.250* 159.033±24.424*

3.2 踝关节滑膜组织JNK1表达水平

与正常对照组相比，模型组大鼠踝关节滑膜组织JNK1蛋白表达明显升高(P＜0.01)，与模型对照组相比，地塞米松组、五味甘露药浴散加减方高剂量组大鼠踝关节滑膜组织JNK1蛋白表达明显降低(P＜0.01)，中剂量组、低剂量组大鼠踝关节滑膜组织JNK1蛋白表达降低(P＜0.05).如表3图1.

表3 各组大鼠踝关节炎滑膜组织JNK1表达水平比较(±s，n=10)Table 3 Comparison of JNK1 expression of the synovial membrane of adjuvant arthritis rats

表3 各组大鼠踝关节炎滑膜组织JNK1表达水平比较(±s，n=10)Table 3 Comparison of JNK1 expression of the synovial membrane of adjuvant arthritis rats

注:与模型组比较 *P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量＊＊模型对照 - 0.2193±0.0165地塞米松 0.150mg.kg-1 0.1796±0.0181＊＊五味甘露药浴散加减方 26.00g.L-1 0.1978±0.0240*52.00g.L-1 0.1984±0.0264*104.00g.L-1 0.1916±0.0223 JNK1正常对照 - 0.1672±0.0155＊＊

图1 大鼠右踝关节滑膜组织免疫组化(IHC×400)A.正常对照组;B.模型组;C.地塞米松组0.150mg.kg-1;D.五味甘露药浴药浴散加减方低剂量组26.00g.L-1;E.五味甘露药浴药浴散加减方中剂量组52.00g.L-1;F.五味甘露药浴药浴散加减方高剂量组104.00g.L-1Fig.1 Immunohistochemistry of Ankles in Adjuvant Arthritis Rats(IHC ×400)A.nomal group;B.model group;C dexamethasone group(0.150mg.kg-1);D Ganlu-Yaoyu-San in high dose group(104.00g.L-1);E Ganlu-Yaoyu-San in middle dose group(52.00g.L-1);F Ganlu-Yaoyu-San in low-dose group(26.00g.L-1)

4 讨论

目前治疗RA的药物主要集中在非甾体抗炎药、肾上腺糖皮质激素，免疫抑制剂等，上述药物以缓解症状为主，不良反应较多，患者耐受性差［6］.藏药浴是依据藏医药的基础理论在温泉浴疗法实践的基础上创造的一种藏医独特的药物外治类风湿的方法，“五味甘露”方是藏药浴的基础配方.研究表明五味甘露颗粒能抑制各种炎症模型所致炎症，并有显著的镇痛作用［7］.对中医寒湿痹阻、湿热疲阻、肝肾亏虚、痰癖痹阻型类风湿关节炎均能起到良好疗效，尤其对寒湿痹阻型类风湿关节炎疗效显著.

足跖肿胀率是评价AA模型后肢炎症轻重程度的外部客观指标［8］，研究表明，RA的发病与多种自身抗体及细胞因子相关，包括类风湿因子(RF)、环瓜氨酸多肤抗体(抗一 CCP)及葡萄糖-6-磷酸异构酶(UPI)等［9］.Vittccoq 等［10］研究发现，RA 患者体内自身抗体的产生明显早于患者临床表现及影像学表现，对RA的早期诊断具有重要价值.RF作为RA检测的重要指标，是损伤指标中最强有力的预后因子［11］.有研究表明高滴度RF与类风湿关节炎的关节侵蚀密切相关.MAPK信号通路参与了类风湿关节炎中关节滑膜的炎症反应，以往研究发现在类风湿关节炎滑膜中JNK和p38途径的活化明显增强［12-13］，参与关节局部炎症及骨质破坏，具有重要的致病意义.JNK是转录因子的关键调节者，其抑制剂对控制RA有一定疗效.JNK抑制剂可下调MMPs的表达，减少软骨的破坏，对软骨有一定的保护作用［14-15］.研究表明，JNK磷酸化和胶原酶基因表达都需要TNF-a，IL-1的有效诱导，它们是RA发病中重要的炎症因子.

本实验研究结果表明，五味甘露药浴散加减方能有效减小致炎侧足跖肿胀率，提示该药药浴可以明显改善AA大鼠的关节炎症程度，对类风湿关节具有一定的治疗作用.进一步研究发现该药可明显降低AA大鼠血清中RF的水平，抑制踝关节滑膜组织JNK1的表达.提示其治疗类风湿关节炎的机制可能与其降低血清RF含量，抑制JNK1的表达有关.

［1］刘维，高春鹤，薛斌，等.五味甘露药浴颗粒治疗类风湿关节炎临床研究［J］.中华全科医学，2012 ，10(6):855-856.

［2］林扎西卓玛.藏医药浴“五味甘露药水浴”之研究［J］.中国民族医药杂志，2013，5(5):28-31.

［3］贡巴，关却才让.浅谈藏药五味甘露方［J］.中国民间疗法，2015，23(4):72-73.

［4］冯欣.藏药五味甘露药浴现代研究的现状与预测［J］.中国藏学，2014 ，(2):168-170.

［5］陈锋，郑海磊，倪林英，等.复方霍山石斛含片清咽功能的动物试验研究［J］.安徽农业科学，2014，42(29):10131-10133.

［6］卢秀花.草木樨流浸膏片对类风湿性关节炎的疗效观察［J］.中药药理与临床2015;31(1):258-260.

［7］李广全，郭建新，李萍，等.五味甘露药浴精抗炎作用研究［J］.中成药，2001，23(3):223-225.

［8］艾坤，武丹，常小荣，等.电针对佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀度和炎性细胞因子的影响［J］.中国康复理论与实践，2011;17(7):622-624.

［9］张静思，陈鑫苹，陈斌.RF、抗一CCP，AKA及GPI联合检测在类风湿关节炎诊断中的价值［J］.2015，44(13):1788-1793.

［10］VITTCCOQ O，INCAURGARAT B，JOUCN-BCADES F，et al.Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinatcd and non-citrullinated rccombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis［J］.Clin Exp Immunol，2004，135(1):173-180.

［11］BIESEN R，BURMESER GR，HIEPE F.Rheumatoid factor or antinuclear antibodies as incidental finding［J］.Internist(Berl)，2014，55(10):1157-1164.

［12］RALPH JA，MORAND EF.MAPK phosphatases as novel targets forrheumatoid arthritis［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12(7):795-808.

［13］SCHETT G，TOHIDAST-AKRAD M，SMOLEN JS，et al.Activation，differentialLocalization，and regulation of the stress— activatedprotein kinases，extracellular signal— regulated kinase，c-JUN N-terminal kinase，and p38 mitogen— activated protein kinase，insynovial tissure and cells in rheumatoid arthritis［J］.ArthritisRheum，2000，43(11):250-2512.

［14］LIACINI A ，SYLVESTER J，LI WQ，et al.Induction of matrix metalloproteina se-13 gene expression by TNF-a is mediated by MAP kinases，AP-1，and NF-KB transcription factors in articular chondrocytes［J］.Exp Cell Res，2003，288(1):208-217.

［15］HAN Z，BOYLE DL，CHANG L，et al.c-Jun N-terminal kinase is required for met-alloproteinase expression and joint destruction in inflammatory arthritis［J］.Clin Invest，2001，108(1):73-81.

Effect of Ganlu-Yaoyu-San on rats with adjuvant arthritis Serum RF level and JNK1 of synovial tissue

WEI Ting，LIU Yu，WANG Tian-hong，WU Jia-si，ZHANG Yi，ZENG Yong
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，P.R.C.)

This article studied the efficacy of Ganlu-Yaoyu-Sanon the rats with adjuvant arthritis，and its effect on the levels of serum RF and the expression of JNK1 in ankle synovial tissue.The model of arthritis in rats was induced by Freund＇s complete adjuvant(FCA).The inflammatory side paw swelling rate was used to evaluate the treatment effect of Ganlu-Yaoyu-San in AA rats.The level of serum RF was tested by ELISA and the expression of JNK1 in ankle joint synovial tissue was determined by immuno-histochemistry.The results showed that high dose of Ganlu-Yaoyu-San could significantly reduce the AA rats inflammatory side swelling rate(compared with model group，P＜0.05)with 4 weeks of treatment.With 2 and 4 weeks of treatment，in high dose group of Ganlu-Yaoyu-San the level of serum RF was significantly lower than that in model group(P＜0.05).Moreover，each dosage Ganlu-Yaoyu-San group could significantly reduce the expression of JNK1 in ankle synovial tissue(P＜0.05 orP＜0.01).Ganlu-Yaoyu-San could effectively reduce the inflammatory side foot swelling rate in adjuvant arthritis rat and the mechanism might be related to the effect on the level of RF in serum and the expression of JNK1 in ankle synovial tissue.

Ganlu-Yaoyu-San;adjuvant arthritis;swelling rate;RF;JNK1

R285

A

2095-4271(2015)06-0708-05

10.11920/xnmdzk.2015.06.009

2015-08-29

韦婷(1990－)，女，汉族，四川人，在读硕士研究生，研究方向:中药药效与毒理研究，E-mail:949856850@qq.com

曾勇(1976－)，男，汉族，四川人，博士，副教授，研究方向:中药药效与毒理研究E-mail:286840942@qq.com

国家自然科学基金地区科学基金项目(81260672);四川省科技厅省青年科技创新研究团队专项计划项目(2014TD0007)

(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏;英文编辑:周序林，郑玉才)