酸敏感钾通道-3真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达*

魏林郁，李新娟，梅懿文，王国红，王 琪，李东亮，李超堃△

(1.新乡医学院基础医学院生理学与神经生物学研究室，河南 新乡 453003;2.郑州大学第一附属医院消化实验室，河南 郑州 450052)

双孔道钾通道(tandem pore domain K channel，K2P)编码细胞的背景钾电流，是静息电位形成的主要通道［1］。酸敏感钾通道(tandem pore domain acidsensitive potassium channel，TASK)作为 K2P 家族一员，是一种酸度敏感性外向整流钾通道。在缺血脑损伤过程中发挥重要的神经调节作用［2，3］。在TASK家族中，TASK3(KCNK9)为pH敏感亚基，在生理环境(pH 7.4)主要表现为开放状态，只有在H+浓度较高的酸性环境中才转变成关闭状态［4］，其活性随着H+浓度的升高以及氧含量降低而显著降低［2，3］。作为钾离子通道，主要通过调节膜静息电位水平从而调节神经系统的兴奋性，以阻止过度钾外流引发的细胞渗透压平衡紊乱所造成的细胞死亡［5］。研究表明，缺血引发的酸化过程中 TASK3 K+通道由缺血前的开放状态逐步变成关闭状态是引发神经元去极化的主要诱因之一。

目前TASK3蛋白在体外培养的细胞系中表达丰度普遍极低，使得利用体外培养细胞研究TASK3的功能成为难点。本研究旨在克隆人脑组织TASK3基因，对TASK3 C末端进行绿色荧光蛋白(eGFP)融合，构建TASK3重组真核表达载体;将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中，建立稳定过表达TASK3的细胞株，为体外研究TASK3通道功能提供细胞模型，也为进一步探讨TASK3通道在脑缺血酸化诱发神经损伤的分子机制，寻找药物治疗脑缺血损伤的新靶标奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人脑组织TASK3(KCNK9)全长cDNA购自美国Open Biosystems公司;SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库;pEGFP-N1载体购于GENECHEM公司;感受态大肠杆菌DH5a购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要试剂

胎牛血清购自美国Hyclone公司;DMEM高糖培养基、青-链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司;X-fect转染试剂盒购于美国Clontech公司;PCR试剂盒、限制性内切酶QuickCut DpnI购自日本TaKa-Ra公司;去内毒素质粒小抽试剂盒购自美国OMEGA公司;TASK3兔抗大鼠多克隆一抗购自美国Sigma Aldrich公司;LB培养基、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE电泳液、Western blot转膜液、牛血清白蛋白BSA、GAPDH兔抗大鼠多克隆一抗、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗购自碧云天生物技术研究所;RTPCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(KCNK9上游引物:5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGAAGAGGCAGAACGTGCGGAC-3’;KCNK9下游引物:5’-CGCCCTTGCTCACCATAACG GACTTCCGGCGTTTCA-3’;pEGFP-N1 引物:N1-end-FWD:5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’;N1-start-REV:5’-GCTAGCGGATCTGACGGTTCAC-3’;pEGFP-N1 测序引物:N1-Seq FWD:5’-TGGGAGT TTGTTTTGGCAC-3’;N1-Seq REV:5’-GGACACGCTGAACTTGT GG-3’)。

1.3 TASK3基因亚克隆及pEGFP-N1重组质粒的构建

采用李超等［6］快速克隆方法，亚克隆TASK3基因到真核表达载体pEGFP-N1。利用PCR扩增TASK3基因。引 物 如 下:KCNK9-FWD:5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGAAGAGGCAGAACGTGCG GAC-3’;KCNK9-REV:5’-CGCCCTTGCTCACCATAAC GGACTTCCGGCGTTTCA-3’，下划线为去除终止密码子的TASK3开放阅读框，其余序列是同pEGFP-N1进行融合的互补的16个碱基的重叠序列。同时，利用PCR反向扩增pEGFP-N1载体，引物如下:N1-end-FWD:5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’;N1-start-REV:5’-GCTAGCGGATCTGACGGTTCAC-3’。PCR反应体系如下:5 x Phusion 扩增缓冲液10μl，2.5 mmol/L dNTP 6μl，上游引物(5μmol/L)1μl，下游引物(5μmol/L)1μl，模板(10ng/μl)1μl，Phusion DNA 聚合酶 0.5μl，补充灭菌水至50μl，瞬时离心混匀。PCR反应参数:98℃ 2 min;98℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 90s，共18 个循环;72℃再延伸5 min后冷却至4℃。反应完成后1%琼脂糖电泳检测TASK3和pEGFP-N1载体PCR产物。PCR产物检测正确后，在PCR产物中直接加入1μl DpnI，瞬时混合后在37℃培养箱内消化3 h，进行转化实验。转化实验步骤:5μl消化后pEGFP-N1和TASK3扩增产物进行混合，室温放置30min，取2μl混合产物加入到100μl DH5a感受态细胞中冰浴30min，再进行42℃热激处理60s，0℃冰浴60s，最后在无抗生素的LB液体培养基中恢复1 h后，均匀涂布于含100μg/ml的氨苄抗性LB固体培养基，过夜培养15～18 h。

1.4 重组质粒的鉴定和提取

在含有氨苄抗性的LB固体培养基上随机挑取6个单克隆菌落，放置于5 ml含有50μg/ml氨苄的培养基中37℃过夜培养，随后使用TASK3引物做菌液PCR鉴定TASK3阳性克隆。菌液PCR反应参数:94℃ 5 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2 min，共25个循环;72℃再延伸10min后冷却至4℃。反应完成进行1%琼脂糖电泳检测PCR产物。选取能扩增出约1.2 kb TASK3条带的克隆，按照OMEGA公司无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行质粒抽提;将同一阳性克隆菌液送至北京英俊公司用pEGFP-N1测序引物进行测序。重组质粒命名为pEGFP-TASK3。

1.5 建立稳定表达TASK3-eGFP的SH-SY5Y细胞株

SH-SY5Y细胞接种于6孔板中，待细胞生长密度达到50% ～60%时，按照美国Clontech公司的x-fect转染试剂盒说明书书将pEGFP-TASK3质粒转染SH-SY5Y细胞。4h后换正常培养基进行培养，48 h后荧光显微镜观察重组蛋白的表达情况，72 h后胰酶消化转染细胞，使用流式细胞仪进行488 nm荧光激发，筛选带绿色荧光的阳性细胞，将其植入培养皿中培养2周，使用含 G418(600mg/L)的选择性培养基筛选耐药且能表达绿色荧光蛋白的克隆，48 h换液1次。2周后荧光显微镜观察筛选绿色荧光细胞，用胰酶消化分散细胞，梯度稀释至终浓度为每10ml培养基中含100个细胞。取100μl接种培养基至96孔板内，确保96孔板每孔中1个细胞，同时做2个96孔板的平行接种。使用含G418(600μg/ml)培养基培养细胞2周，48 h换液1次。荧光显微镜鉴定获得稳定转染的单克隆细胞并扩大培养。

1.6 激光共聚焦观察TASK3-eGFP的细胞表达

将稳定表达绿色荧光的SH-SY5Y细胞株接种于活细胞成像培养皿，待细胞贴壁培养48 h后，置细胞成像培养皿于激光共聚焦显微镜下做40倍荧光观察。使用层扫描对稳定转染及野生型SHSY5Y细胞进行荧光定位。

1.7 Western blot检测TASK3-eGFP的表达

选取荧光显微镜观察到的带绿色荧光的单克隆细胞扩大培养，取第3代细胞去除培养基，PBS洗1遍，经RIPA裂解液裂解辅助超声破碎细胞，4℃离心机12000x g离心10min，收集上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取含40μg细胞蛋白的提取液，加样品缓冲液煮沸变性，10%SDS-PAGE进行蛋白分离，湿转法转移蛋白至硝酸纤维素膜上，3%BSA 37℃封闭1 h，随后加入兔抗大鼠TASK3一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，再与碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(1∶1000)37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，硝酸纤维素膜用BCIP/NBT显色系统显色，以兔抗大鼠GAPDH一抗为内参照。

1.8 CCK-8检测细胞存活率

取对数期SH-SY5Y细胞以2×104cells/well接种于96孔塑料培养板中，每孔加入100μl培养基;24h后弃去培养基，分别加入不同pH值(7.0、6.7、6.4、6.1)培养基 200μl处理 24h，野生型 SH-SY5Y细胞对照组和稳定表达TASK3-eGFP的SH-SY5Y实验组各设3个复孔。处理因素完成后，每孔加入10μl CCK-8，37℃孵育2 h 后，用酶标仪 450nm 波长处读取吸光度(A)值。按照公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)×100%。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 PCR扩增TASK3基因和重组质粒pEGFPTASK3的鉴定

以人脑组织TASK3 cDNA和真核pEGFP-N1载体为模板，利用TASK3引物和pEGFP-N1反向引物进行PCR扩增，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，可见在约1.2 kb和4.7 kb处各有1条带，分别与预计目的条带TASK3和pEGFP-N1大小位置相符(图1a)。两种PCR产物1∶1混合并用DpnI消化过夜，再转化DH5a感受态细胞，接种至含卡那霉素的LB琼脂糖培养板上，37℃培养过夜，随机挑选6个单克隆菌落，进行菌液PCR扩增，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，除第4泳道外，其余5个泳道均可见约1.2 kb处有1条带，与目的条带TASK3位置符合(图1b)。

Fig.1 TASK3 cDNA amplified by PCR and identification of recombinant plasmid pEGFP-TASK3

2.2 TASK3-eGFP在稳定转染SH-SY5Y细胞株的细胞膜定位

TASK3钾离子通道是一种膜蛋白，主要表达在细胞膜上。对TASK3 C末端进行绿色荧光蛋白(eGFP)融合，利用激光共聚焦显微镜层扫描鉴定TASK3-eGFP在稳定转染SH-SY5Y细胞系中的表达。结果显示，正常SH-SY5Y细胞无绿色荧光(图2b);而表达TASK3-eGFP的SH-SY5Y细胞中，仅在细胞膜上显示绿色荧光，胞浆和胞核绿色荧光显示阴性(图2d)。

Fig.2 Surface localization of TASK3-eGFP in SH-SY5Y cells by confocal microscopy

2.3 Western blot检测TASK3-eGFP蛋白的表达

用TASK3抗体检测结果显示，SH-SY5Y-eGFP tag-TASK3细胞系样品对应泳道均可见在约73 kDa(TASK3-eGFP)处有明显的免疫杂交条带，而野生型SH-SY5Y细胞样品对应泳道未见阳性条带(图3)。

Fig.3 Expression of fusion protein TASK3 tagged with eGFP in SH-SY5Y cells

2.4 CCK-8检测细胞存活率

采用CCK-8检测细胞存活率，结果显示:不同pH 值(7.0、6.7、6.4、6.1)培养基处理 SH-SY5Y 细胞24h后，野生型SH-SY5Y细胞存活率分别是(100±1.2)%、(87.2±1.5)%、(62.5±3.2)%、(46.5±1.6)%;转染TASK3的SH-SY5Y细胞存活率分别是(100±0.8)%、(94.5±3.1)%、(74.5±5.3)%、(55.7±2.4)%。经统计学分析，两组细胞的存活率随着pH值降低而显著性降低(P＜0.05)。相同pH值下(除pH 7.0)，转染组细胞存活率显著性高于野生型细胞(P＜0.05)。

Fig.4 Cell viability of SH-SY5Y measured with CCK-8 assay(，n=6)

3 讨论

TASK3 K+通道作为TASK家族pH敏感亚型，广泛分布于脑中，主要通过调节细胞膜静息电位水平而调节神经系统的兴奋性。当细胞外pH值从7.2降至6.4和6.0时，TASK3电流分别被抑制74%和96%，以阻止过度钾外流引发的细胞渗透压平衡紊乱所造成的细胞死亡。近年来研究证实，TASK3 通道参与脑缺血的发生过程［3，8］。脑缺血时，氧供给不足，无氧酵解产生的乳酸及ATP水解产生的质子引起酸毒症，脑组织pH值可降至6.0～6.5［7］，TASK3通道由缺血前的开放状态逐步蜕变成关闭状态，造成神经元去极化。而去极化作用将极大促进神经递质及小肽物质的过度释放，过多的神经递质的释放又加重TASK3诱导的膜去极化作用，但具体分子机制还不清楚。目前，在体研究TASK3在脑缺血损伤中的作用更多在TASK3基因敲除(转基因)动物进行。然而由于培养细胞表达TASK3水平较低，使得体外深入研究TASK3功能受到限制。

本实验欲通过亚克隆TASK3基因到真核表达载体pEGFP-N1，利用转染方法在SH-SY5Y细胞中过表达TASK3蛋白，为进一步探讨TASK3对脑缺血损伤可能的作用及机制奠定研究基础。本实验中，利用pEGFP-N1质粒(带绿色荧光蛋白的报告载体)、采用双酶切定向克隆的方式(避免自连和反向连接)构建TASK3重组真核表达载体。pEGFP-N1包含增强型绿色荧光蛋白基因EGFP，由于细胞本身没有EGFP基因，将EGFP和另一基因的编码区相连得到融合体，可以研究目的蛋白的定位，其荧光强弱取决于蛋白的含量，GFP与外源基因偶联时一般不影响外源蛋白的构象和功能，可为应用流式细胞筛选或其他方式对瞬时转染哺乳动物细胞表达EGFP及目的蛋白的有效率提供一个依据［9］;含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达;结构上，该质粒具有很强的复制能力，可以满足宿主细胞分裂时跟随细胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一;具有新霉素抗性(neo)基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。此外，采用含Ampi的LB选择性培养基筛选含Ampi转化子的质粒，并经过酶切初步鉴定克隆正确，最后经过DNA测序分析确定所插入的目的基因片段的正确性。

本研究利用pEGFP-N1质粒的特性，使用流式细胞仪筛选出瞬时转染带绿色荧光的TASK3阳性细胞，扩大培养后接种在96孔板中使每孔仅有1个阳性细胞，确保表达TASK3细胞株的稳定传代;利用Western blot检测出该稳定细胞株TASK3蛋白的高表达;激光共聚焦显微术进一步证实了EGFP绿色荧光蛋白同TASK3蛋白融合后主要定位在细胞膜上，实现对TASK3标记和示踪;利用CCK-8检测不同pH值作用稳定细胞株24h后的存活率，从功能上证实稳定细胞株中TASK3通道具有酸敏感性。因此，本实验成功构建了稳定表达TASK3-eGFP蛋白的SH-SY5Y细胞株，并为体外研究TASK3功能提供细胞模型和实验基础。TASK3也有望成为缺血性脑病发生的分子生物学治疗靶点，深入研究TASK3或许可为脑缺血损伤的临床防治提供新策略。

［1］董 侃，陶谦民，夏 强.双孔钾通道研究进展［J］.浙江大学学报(医学版)，2005，34(5):476-480.

［2］Berg AP，Talley EM，Manger JP，et al.Motoneurons express heteromeric TWIK-related acid-sensitive K+(TASK)channels containing TASK-1(KCNK3)and TASK-3(KCNK9)subunits［J］.J Neurosci，2004，24(30):6693-6702.

［3］Meuth SG，Kleinschnitz C，Broicher T，et al.The neuroprotective impact of the leak potassium channel TASK1 on stroke development in mice ［J］.Neurobiol Dis，2009，33(1):1-11.

［4］Rajan S，Wischmeyer E，Xin Liu G，et al.TASK-3，a novel tandem pore domain acid-sensitive K+channel:An extracellμLar histamine as pH sensor［J］.J Biol Chem，2000，275(22):16650-16657.

［5］Lauritzen I，Zanzouri M，Honoré E，et al.K+-dependent cerebellar granule neuron apoptosis:role of TASK leak K+channels［J］.J Biol Chem，2003，278(34):32068-32076.

［6］Li C，Wen A，Shen B，et al.FastCloning:a highly simplified， purification-free， sequence-and ligation-independent PCR cloning method ［J］.BMC Biotechnol，2011，11:92.

［7］Pignataro G，Simon RP，Xiong ZG.Prolonged activation of ASIC1a and the time window for neuroprotection in cerebral ischemia［J］.Brain，2007，130(Pt 1):151-158.

［8］Ehling P，Bittner S，Bobak N，et al.Two pore domain potassium channels in cerebral ischemia:a focus on K2P9.1(TASK3，KCNK9)［J］.Exp Transl Stroke Med，2010，2(1):14.

［9］冯 红，徐文琳，战 锐，等.pEGFP-N1质粒转染乳鼠心肌细胞的分布及效率［J］.中国应用生理学杂志，2005，21(1):112-114.