桂花多糖体外免疫活性的研究

尹 伟，陶阿丽，戴 一，施伶俐，张国升

（安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088）

多糖作为天然生物体大分子物质，具有多种多样的生物活性，如增强机体免疫功能、抗氧化作用，并在抗肿瘤方面发挥着重要的生物活性作用.据报道[1]，植物多糖的免疫调节作用可能是通过激活机体免疫细胞活性，以促进这些细胞对IL-2、IFN-γ、TNF-α 等细胞因子的分泌，从而产生一定的免疫调节作用.亦有报道表明[2]，植物多糖的这些免疫作用可能与抗肿瘤作用密切相关.目前报道较多的植物多糖，如半夏多糖、青蒿多糖等均具有调节机体细胞免疫功能以及抑制肿瘤细胞作用[3].

桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，为木犀科木犀属植物，是木犀科常绿灌木或小乔木.《本草纲目》记载：桂花，味甘、辛，性温，能暖胃、益胃、驱寒，并具有疏肝理气、祛痰止咳和顺肺开胃的功效[4].现代研究表明[5]，桂花具有降血糖、抗炎、抑菌、体内外抗氧化和清除自由基等生物活性.桂花多糖是桂花的重要成分之一，但是目前对桂花的研究主要集中在桂花精油方面，而对桂花多糖的免疫活性则尚未见报道.

本课题在前期研究的基础之上，拟使用前期得到的桂花多糖作为原料，考察桂花多糖的体外免疫活性，旨在为临床新药研发提供一定的参考.具体报道如下：

1 材料

1.1 主要试剂

二甲基亚砜(DMSO，上海市欣诚试剂有限公司)；RPMI-1640(上海元龙生物技术有限公司)；胎牛血清(江苏泽雨生物科技有限公司)；刀豆蛋白A(ConA，上海丰寿生物科技有限公司)；MTT(噻唑蓝，上海丰寿生物科技有限公司)；台盼蓝(上海恒远生物科技有限公司)

1.2 主要仪器

CO2细胞培养箱(上海百典仪器厂)；HZS-H水浴振荡器(金坛市精达仪器制造有限公司)；

96孔细胞培养板(上海研拓生物科技有限公司)；550型酶标仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)

1.3 实验动物

SPF级昆明种小鼠，购自安徽医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002号.

2 方法

2.1 制备鼠脾淋巴细胞

取SPF级昆明种小鼠，处死(颈椎脱臼方法)，乙醇(75%)中浸泡(5min)，无菌手术将其脾脏取出，使用PBS洗3次.用消毒无菌镊子轻轻捻碎脾脏，过筛(200目)，最终得到细胞悬液，离心，加入0.85%NH4Cl裂解红细胞，冲打，静置约10min，离心，收集细胞，冲洗，检测细胞存活率(台盼蓝方法)>96%.用RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute)培养基，转至培养板中(96孔)，于培养箱(37℃，5% CO2)中培养.

2.2 测定细胞浓度和存活率(台盼蓝法)

将细胞悬浮液(100ul)与0.2%(100ul)的台盼蓝溶液混匀，加入500mlNaCl(0.9%)，镜检.其中，细胞数(每毫升)=大个中平均或细胞的数目×104/ml×稀释倍数；细胞存活率=活细胞数目/总细胞数目×100%，细胞存活率应>90%.

2.3 桂花多糖的毒性试验(脾淋巴细胞)

将小鼠脾细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，100ul/孔；加样品，100ul/孔；相关阴性对照组中只加培养基(RPMI-1640).平行三复孔.放置细胞培养箱中(37℃，5%CO2)48h.取出细胞板，加MTT(噻唑蓝)，20ul/孔，放置培养箱中继续培养5h.取出，离心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同时震荡5min.用酶标仪测定(OD570nm).

2.4 桂花多糖诱导的淋巴细胞增殖测定

将小鼠脾细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，100ul/孔；加样品，100ul/孔；分别设置阳性和阴性对照，其中，ConA浓度为10ug/ml.平行三复孔.放置细胞培养箱中(37℃，5%CO2)72h.

取出细胞板，加MTT(噻唑蓝)，20ul/孔，放置培养箱中继续培养5h.取出，离心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同时震荡5min.用酶标仪测定(OD570nm).

2.5 ConA诱导的脾淋巴细胞增殖测定

将小鼠脾细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，150ul/孔；在空白组中加25ulPRMI-1640培养基，阳性对照组加ConA 25ul，相关试验组加ConA溶液分别为25ul，且浓度相同，再加样品溶液25ul，最终用培养基将体积补充至200ul.检测方法同上.

2.6 桂花多糖与ConA联合诱导淋巴细胞增殖测定

将小鼠脾细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，100ul/孔；随后加入样品与Con A，50ul/孔，浓度为5ug/ml.同时设置阴性、阳性与空白对照组.检测方法同上.

2.7 桂花多糖对Con A诱导IL-2、IFN-γ 及TNF-α 分泌的作用

2.7.1 桂花多糖联合ConA诱导淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ 的细胞培养液上清的制备

将小鼠脾细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，100ul/孔；加样品、ConA，100ul/孔，其中，ConA浓度为5ug/ml.同时设置阴性、阳性与空白对照组.平行三复孔.放置细胞培养箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培养液，离心(2500rpm，5min)，过滤沉淀，上清液备用(-20℃保存).

2.7.2 桂花多糖联合Con A诱导巨噬细胞分泌TNF-α 的细胞培养液上清的制备

将巨噬细胞悬液加至细胞培养板(96孔)，1ml/孔，放置细胞培养箱中(37℃，5%CO2)2h，并去除上清液，洗去非黏附细胞(Hank’s溶液)；加样品、Con A，50ul/孔，其中，ConA浓度为5ug/ml.同时设置阴性、阳性与空白对照组.平行三复孔.放置细胞培养箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培养液，离心(2500rpm，5min)，过滤沉淀，上清液备用(-20℃保存).

2.7.3 细胞培养液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的测定

根据ELISA试剂盒程序测定OD492值，绘制标准曲线，算出IL-2、IFN-γ 及TNF-α 的浓度.

2.8 统计学方法

所有研究数据均采用SPSS17.0统计学软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，并采用t检验.

3 实验结果

3.1 桂花多糖的细胞毒性作用

研究结果显示，桂花多糖1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml的OD570nm值分别为 (0.264±0.04)、(0.341±0.01)、(0.502±0.02)，显著优于阴性对照组的数值(0.113±0.02)，表明桂花多糖对淋巴细胞转化增值，效果明显，无显著细胞毒性.

表1 桂花多糖以及联合诱导的淋巴细胞增殖试验

表1 桂花多糖以及联合诱导的淋巴细胞增殖试验

试验组样品单一诱导 联合诱导阴性对照组 0.126±0.01 0.109±0.01 ConA对照组 0.315±0.03 0.302±0.01 1 0.298±0.01 0.333±0.02桂花多糖(ug/ml)10 0.366±0.03 0.373±0.03 100 0.440±0.02 0.444±0.03 1 0.281±0.01 0.286±0.02香菇多糖(ug/ml)10 0.356±0.02 0.348±0.03 100 0.418±0.03 0.397±0.04

3.2 桂花多糖及桂花多糖联合诱导的淋巴细胞增殖测定

通过试验数据可得出，桂花多糖试验组的OD570nm数值均大于对照组，提示桂花多糖对鼠脾淋巴细胞有较好的增殖作用，同时依据剂量的加大(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)，诱导作用亦逐渐加强.另，桂花多糖与香菇多糖OD570nm值较为接近，显示了桂花多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用方面，与香菇多糖效果相当，同时均大于ConA的作用效果.详见表1.

3.3 细胞培养液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的测定

3.3.1 标准曲线的绘制

IL-2含量测定标准曲线：

y=1.4421x-1.9934(r=0.9992)；

IFN-γ 含量测定标准曲线：

y=1.6001x-1.5329(r=0.9939)；

TNF-α 含量测定标准曲线：

y=1.6044x-1.7171(r=0.9992)；

3.3.2 桂花多糖对ConA诱导的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指标分泌的影响对比

通过试验数据得出，桂花多糖实验组的细胞因子浓度显著优于对照组，显示了桂花多糖对Con A诱导的细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)分泌促进效果显著，同时与剂量大小在一定范围内，保持一定的正相关.且同香菇多糖对细胞因子分泌的促进作用相比，在一定程度上，效果优于香菇多糖.

表2 桂花多糖联合Con A诱导的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指标情况对比

4 小结

研究显示[6-8]，植物多糖在抗肿瘤、免疫、心血管、抗衰老等方面都具有较为重要的作用，目前已经成为广大医药学工作者的研究热点.随着分子生物学，生物化学等学科研究的发展，植物多糖的研究也越来越深入.同时，科学家们亦将多糖的研究提到了生命科学的前沿，提出了“二十一世纪是多糖的世纪”的概念.

本研究结果显示，桂花多糖无显著的细胞毒性，对淋巴细胞诱导的增殖转化效果明显，并且对IL-2、IFN-γ、TNF-α 的分泌有很强的促进作用，同时在一定程度上，随着剂量增大，效果亦显著，与香菇多糖的作用效果相当.

综上，系统的研究桂花多糖的免疫活性，对其抗肿瘤作用的研究，奠定一定的基础.

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〔3〕李松，吴青华，陈畅，等.多糖抗肿瘤活性的最新研究进展[J].中国生化药物杂志，2007，28(3)：213-215.

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〔5〕刘龙昌，向其柏.木犀属植物的研究进展[J].南京林业大学学报（自然科学版），2013，27(2)：84-85.

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