鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

杨建珍，朱红英

（新干县畜牧兽医局,江西 吉安 331300）

大肠埃希菌(E．coli)是家禽最常见的病原菌之一。鸡大肠杆菌病是由致病性埃希氏大肠杆菌所致的一种鸡的常见多发病，有原发性的，也有并发或继发性的。发病率及死亡率高。该病目前已成为危害养鸡业健康发展的重要细菌性传染病之一[1]。该病的流行无明显季节性，一年四季均可发生，尤以冬末春初易发。主要危害幼鸡和肉鸡。病型复杂，临床上主要所致疾病有：大肠杆菌性败血症、大肠杆菌性肉芽肿、气囊炎、滑膜炎、肝周炎、头肿综合症、腹膜炎、输卵管炎、全眼球炎及脐炎[2]。鸡大肠杆菌病的发生具有一定的条件性，病原可能是外来的致病型大肠杆菌，也可能是体内正常情况下存在的大肠杆菌，当环境因素改变或发生应激因素引起发病[3]。病鸡和带菌鸡的粪便、呼吸道勃液及蛋内和蛋壳表面带有大量的致病性大肠杆菌，常造成禽舍环境、用具、饲料、饮水等的严重污染，成为本病传播的主要原因[4]。近年来，随着养鸡业的集约化发展，鸡大肠杆菌病不断蔓延，其波及的鸡种、发病率及严重程度呈不断增长趋势，已居鸡细菌性疾病之首，给养鸡户造成巨大的经济损失，严重危害了养鸡业的发展[5]。

新干县一规模化鸡场的5～7周龄鸡突然发病，发病率为100%，病死率为60%左右。主要症状为剧烈腹泻，精神沉郁，眼睑肿胀，有的鸡迅速死亡。通过对死鸡肝脏和活鸡肝脏中病原菌的分离及生化鉴定，为该鸡场的病情诊断提供了依据，最后通过药敏试验初步得出其敏感药物，为疾病的临床治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料。无菌条件下取新干县某规模鸡场送检的病死鸡和病鸡肝脏。

1.1.2 染色液。革兰氏碘液、草酸铵结晶紫、95%酒精、沙黄水溶液、生理盐水。

1.1.3 药敏纸片。卡那霉素、壮观霉素、红霉素、阿奇霉素、青霉素、硫酸新霉素、泰乐菌素、杆菌肽、甲氧苄啶、安来霉素。以上药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司或自制。

1.1.4 生化试剂。肠杆菌科生化鉴定试剂盒购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.5 普通琼脂培养基。胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠10g、琼脂2%。

1.1.6 其它器材。37℃生化培养箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、普通显微镜、电子天平、电炉、超净台。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 病料的采集。无菌采集病死鸡和病鸡肝脏，并标记为病料A和病料B。迅速置于4℃冰箱保存。

1.2.2 细菌分离。无菌条件下取病料A和B分别用接种环接种到普通琼脂培养基中，37℃培养24h。观察细菌生长和菌落特征。

1.2.3细菌纯化及增菌。分别取初步分离的A菌株和B菌株的单菌落划线接种于新的普通琼脂培养基上，37℃培养24h后挑选典型菌落接种于普通肉汤中，置摇床中以220rpm/min震荡培养9h，得到A菌株和B菌株的纯培养物。

1.2.4 革兰氏染色。按照常规方法涂片进行革兰氏染色镜检[6]。

1.2.5 生化试验。用接种环分别把A菌株和B菌株的纯培养物接种于葡萄糖、乳糖、蛋白胨水等微量发酵管中，并置于37℃生化培养箱中培养24~48h，观察微量发酵管颜色变化。

1.2.6 药物敏感试验。采用圆纸片扩散试验。具体操作：用灭菌棉签从普通肉汤中蘸取A菌株和B菌株的纯培养物致密涂布于普通琼脂平板表面，可重复来回涂布，用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，各片距离要相等，37℃培养24h观察并记录结果[6~7]。

2 结果与分析

2.1 分离菌菌落形态及培养特性

在普通培养基上生长良好，37℃培养24h后长出菌落，直径为1～3mm，圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色、边缘整齐。

2.2 分离菌形态及特征

该菌经革兰氏染色呈阴性，两端钝圆的短杆菌，多呈单个或成双存在，不形成芽胞，能运动。大小一般为 0.4～0.7μm。

在肉汤培养基中培养8～9h后，呈均匀浑浊，管底有少许粘液状沉淀，液面与管壁可形成菌膜。可知该菌在普通肉汤中即可生长良好。

2.3 生化试验结果

本菌生化反应活跃，能分解葡萄糖、乳糖、卫茅醇产酸产气，不分解尿素，不产生硫化氢，不能利用枸橼酸盐，靛基质试验呈阴性，氨基酸脱羧酶试验呈阳性。苯丙氨酸脱氨酶试验呈阴性（表1、表2）。

表1 A菌株生化试验结果

表2 B菌株生化试验结果

2.4 药敏试验结果

表4 B菌株药敏试验结果mm

表3 A菌株药敏试验结果mm

分离的2株鸡致病性大肠杆菌的药敏试验结果表明：A、B两菌株都仅对阿奇霉素高度敏感，对壮观霉素、青霉素中度敏感，对卡那霉素、红霉素、甲氧苄啶等低度敏感或不敏感（表3、表4）。

3 讨论

鉴于鸡群发病后表现的症状如病鸡精神沉郁，缩头闭眼，腹部膨满羽毛逆立，废食，剧烈腹泻，排黄绿色稀粪等，与大肠杆菌病极为相似，故直接用普通琼脂培养基平板划线分离培养，根据分离菌菌落的特征，并经革兰氏染色镜检，A、B两菌株的特性相同，均符合大肠杆菌的特性，表明为同一病原菌。初步认定为大肠杆菌。由生化鉴定结果可知：该菌可发酵葡萄糖、乳糖及卫矛醇，产酸产气；不产硫化氢，不分解尿素；靛基质试验呈阴性；苯丙氨酸脱氨酶试验及枸橼酸盐利用实验均为阴性。这些生化特征进一步证实本次分离菌为大肠杆菌。由表3可知该菌仅对阿奇霉素高度敏感，对青霉素和壮观霉素中度敏感，对其他所用抗生素不敏感或低度敏感，这也正体现了大肠杆菌的耐药性强、耐药谱广的特点。

多年来，对付大肠杆菌的主要措施是应用抗生素，其副作用是致使大肠杆菌病的耐药菌株越来越多，耐药谱也越来越广[9]。一些鸡场为了控制大肠杆菌和其他细菌感染，在饲料中添加或在治疗过程中盲目使用抗生素也是造成大肠杆菌耐药性严重的重要原因。据有关报道，目前大肠杆菌对包括庆大霉素、强力霉素、氯霉素、青霉素、氟哌酸等药物都不同程度地产生了耐药性[10]。由于不同菌株对药物的敏感性存在差异，建议在使用药物治疗病原菌时要加强对病原菌耐药性的检测。因此对病菌进行药敏试验，筛选出对病原菌敏感的药物，指导临床合理用药，可有效减缓细菌耐药性的产生[11]。

大肠杆菌耐药性菌株越来越多，耐药性越来越强，给预防和治疗带来了较大的困难。建议从饲养管理着手搞好环境卫生，对禽舍及用具经常消毒，注意育雏期保温及饲养密度，饲料应无粪便污染，营养要全面[12]。

[1]史喜菊,郑明学,冯柴.鸡大肠杆菌病最新研究进展[J].畜禽业,2000（8）：14～15.

[2]刘远见,蔡海建.病鸡及病死鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]，山东畜牧兽医，2009（2）：24～25.

[3]王铁良.辽宁省鸡大肠杆菌分离、鉴定及药物敏感性试验[J].现代畜牧兽医，2009（7）：64～65.

[4]侯胜,刘德全.鸡大肠杆菌病的病因及防控措施[J].养殖技术顾问,2010（1）：126～127.

[5]陆宗允,朱永仁.鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].畜牧兽医科技信息，2009（4）：44～45.

[6]姚火春主编.兽医微生物学实验指导[M].第二版.北京：中国农业出版社，2001,20～45.

[7]陈杖榴主编.兽医药理学[M].第二版.北京：中国农业出版社，2001,211～221.

[8]陆承平主编.兽医微生物学[M].第二版.北京：中国农业出版社，2001，215～223.

[9]刁有祥，李久芹，陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2002(1)：21～23.

[10]白同臣,曲海波，吴金，等.鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].黑龙江畜牧兽医，2007(9)：78～79.

[11]曾麟.大肠杆菌耐药性的测定 [J].江西畜牧兽医杂志，2010(1)：12～13.

[12]杨明凡，李晓峰，陈红英，等.鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].广东农业科学，2008(11):78～79.