喜马拉雅紫茉莉总多酚含量测定的方法学研究

李兰茹，马慧萍

0 引言

喜马拉雅紫茉莉(Mirabilis himalaica)为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉的干燥根，是藏医常用药物，味甘、辛，具有壮阳、引黄水、治下身寒症［1］、温肾、利尿排石的功效，常用于治疗肾寒浮肿、腰及关节痛、下腹痛及膀胱结石［2］、各种性病及一些病毒感染［3］。目前已发现该药材中含有多种甜菜素、氨基酸、有机酸、三萜、甾体、脂肪酸、葫芦巴碱和半乳糖等多种成分，而对其多酚类物质的研究尚未见报道。多酚是一类抗氧化活性物质的重要成分，具有较高的食品保健和药用开发价值。本实验以喜马拉雅紫茉莉为原料，采用福林酚法(Folin-Ciocalteu Method，FC法)对其总多酚含量进行测定，以期为喜马拉雅紫茉莉的深入开发利用以及质量标准的制定提供科学依据。

1 仪器与试药

UV2800SPC紫外分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，AE200电子天平(上海梅特勒－托利多公司)，SK3300LH型超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)。喜马拉雅紫茉莉药材(产地:甘肃，购于青海西宁三江宝商贸有限公司);没食子酸对照品(批号:110831-200302，中国药品生物制品检定所);钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠、磷酸、盐酸等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 喜马拉雅紫茉莉药材提取液的制备 将供试药材用粉碎机粉碎，过100目筛。取供试药材1 g，精密称定，加入70%乙醇20 mL，超声提取2次(功率160 W，频率59 kHz)，每次15 min，过滤，滤液合并后定容至50 mL量瓶，摇匀，再精密吸取3 mL定容至10 mL，摇匀，即为喜马拉雅紫茉莉提取液。

2.2 对照品溶液的制备 取没食子酸适量，精密称定(0.008 7 g)，置25 mL量瓶中，加去离子水制成每l mL含没食子酸0.348 mg的溶液，低温保存备用。临用稀释成34.8 μg/mL的溶液。

2.3 福林酚(Folin-Ciocalteu，FC)试剂的制备取钨酸钠25 g，钼酸钠6.25 g，加水175 mL、85%磷酸12.5 mL、盐酸25 mL，置磨圆底烧瓶中，缓缓加热回流 10 h，放冷，再加硫酸锂 37.5 g、水12.5 mL和0.2 mL双氧水，开口加热煮沸15 min，使双氧水完全挥发，冷却后用蒸馏水定容至250 mL，过滤，滤液置棕色瓶中避光储存。临用前用水稀释5倍，摇匀，即得。

2.4 显色条件的确定

2.4.1 最大吸收波长的确定 精密量取上述喜马拉雅紫茉莉药材提取液和对照品溶液各1.0 mL，分置10 mL容量瓶中，各加水至2 mL，加FC试剂 2 mL，摇匀，静置 4～5 min，加 7.5%Na2CO3溶液2 mL，加水至刻度，摇匀，置于室温反应15 min后，同时作空白，在波长为 500～900 nm可见光区扫描，绘制吸收曲线。结果对照品溶液和供试品溶液在767 nm处均有最大吸收(图1)，因此，选择测定波长为767 nm。

图1 对照品溶液和供试品溶液紫外吸收图谱注:A.对照品溶液，B.供试品溶液

2.4.2 7.5%Na2CO3溶液最佳用量的确定 精密量取1.0 mL上述喜马拉雅紫茉莉提取液5份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，加FC试剂2 mL，摇匀，静置 4～5 min，分别加入 7.5%Na2CO3溶液1、2、3、4、5 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，置于室温反应60 min后于767 nm波长下测定吸光度，根据吸光度确定7.5%Na2CO3溶液的最佳用量。由图2可知，当7.5%Na2CO3溶液加入量为3 mL时，吸光度最大。

2.4.3 FC试剂最佳用量的确定 精密量取1.0 mL上述喜马拉雅紫茉莉提取液5份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，分别加入FC试剂0.5、1、1.5、2、2.5 mL，摇匀，静置 4 ～ 5 min，加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，置于室温反应60 min后于767 nm波长下测定吸光度，根据吸光度确定FC试剂的最佳用量。由图3可知，当FC试剂的加入量为2 mL时，吸光度最大，故确定FC试剂的最佳用量为2 mL。

图3 FC试剂用量与吸光度的关系

2.4.4 最佳反应时间的确定 精密量取1.0 mL上述喜马拉雅紫茉莉提取液7份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，加入FC试剂2.0 mL，摇匀，静置4～5 min，加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，置于室温反应10、20、30、40、50、60、70 min 后，于 767 nm 波长下测定室温下吸光度随时间的变化，确定最佳反应时间。由图4可知，供试品溶液在室温反应60 min后吸光度趋于稳定，故确定反应时间为60 min。

综上所述，最佳显色反应条件:FC试剂的加入量为2 mL，7.5%Na2CO3溶液加入量为3 mL，常温反应60 min，测定波长767 nm。

2.5 方法学验证

2.5.1 标准曲线的绘制 取没食子酸对照品储备液稀释成34.8 μg/mL的溶液，分别精密量取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分置 10 mL 量瓶中，加水至3 mL，加入 FC试剂2.0 mL，摇匀，静置4～5 min，再加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，用水定容至刻度，摇匀，室温放置 60 min，随行空白，在767 nm处测定吸光度。以没食子酸标准溶液的浓度(C)为横坐标、吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为 A=0.109 4 C+0.008 9，r=0.999 5，结果表明没食子酸在浓度1.74～10.44 μg/mL的范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

图4 显色时间与吸光度的关系

2.5.2 精密度试验 取同一份供试品溶液，测定吸收度值，平均值为0.656 6，RSD=0.07%，表明本法精密度较好。

2.5.3 重复性试验 取同一样品6份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.1”项下的方法制备供试品提取液。精密吸取提取液1 mL，按“2.5.1”项下测定方法测定吸光度。结果RSD为0.86%(n=6)，表明本法重现性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密吸取已知总多酚含量的样品溶液6份，每份0.5 mL，分置10 mL量瓶中，再精密加入没食子酸标准溶液1.0 mL，按“2.5.1”项下测定方法测定吸光度，计算加样回收率。结果平均加样回收率为98.57%，RSD为1.31%。见表1。

2.5.5 喜马拉雅紫茉莉样品中总多酚的含量测定 取过100目筛的供试药材1 g，共6份，精密称定，按“2.1”项下的方法制备供试品提取液。精密吸取提取液1 mL，按“2.5.1”项下测定方法测定吸光度，并根据回归方程计算喜马拉雅紫茉莉总多酚的含量。结果，该法测得样品平均含量为8.946 mg/g，RSD为1.16%。见表2。

表1 加样回收率试验结果

表2 样品中总多酚含量测定结果

3 讨论

目前常用的多酚类物质含量测定的方法有高锰酸钾法、酒石酸亚铁比色法、原子吸收法、紫外分光光度法、福林酚比色法等［4-5］，相比较而言，福林酚法操作简单，重现性好。但福林酚法目前尚无统一的实验条件，文献报道各种植物提取物的测定条件，例如检测波长、加入福林酚的量、缓冲盐碳酸钠的浓度和量、反应体系体积、反应时间及温度等都不尽相同。本文在参考文献［6-11］的基础上，建立了改良的Folin-Ciocalteu比色法，采用该方法测定喜马拉雅紫茉莉总多酚的最佳条件为:FC试剂2 mL，7.5%Na2CO3溶液3 mL，常温反应60 min，测定波长 767 nm。平均回收率为98.57%(RSD=1.31%)，测得喜马拉雅紫茉莉总多酚平均含量为8.946 mg/g。结果表明，该方法操作简便、快捷、稳定，适用于喜马拉雅紫茉莉总多酚含量的测定。本实验曾使用绿原酸作为对照品，但在波长400～900 nm进行全波长扫描时，对照品的最大吸收波长是782 nm，而样品是769 nm，两者相差13 nm。以没食子酸为对照品，两者的最大吸收波长均为767 nm，故以没食子酸作为对照品。

在样品提取实验中，笔者考察了超声和回流两种提取方式，结果样品分别超声、回流提取30 min后含量相差无几，考虑到超声提取方法操作简单，故选择超声提取方法。笔者还考察了不同的乙醇浓度(30%、50%、70%、90%)对总多酚提取效果的影响，结果表明用70%乙醇提取，总多酚含量较高。

综上所述，本文所建立的喜马拉雅紫茉莉总多酚的含量测定方法，将为喜马拉雅紫茉莉的进一步研究工作提供科学依据。

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