针刺对自发性高血压大鼠血压的影响及其抗氧化应激机制研究*

刘 健 ，高 婷 ，万基伟 ，李银虹 ，王 敏

（1.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室，国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室，天津市针灸学重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193；3.天津中医药大学第一附属医院针灸部，天津 300193）

针刺对自发性高血压大鼠血压的影响及其抗氧化应激机制研究*

刘 健1，高 婷2，万基伟2，李银虹2，王 敏3

（1.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室，国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室，天津市针灸学重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193；3.天津中医药大学第一附属医院针灸部，天津 300193）

[目的]观察针刺人迎穴对自发性高血压大鼠（SHR）血压的影响以及体内活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的变化，探讨针刺降压的抗氧化应激机制。[方法]将SHR随机分为针刺组、模型组，以京都Wistar大鼠（WKY）作为血压正常的对照组。针刺组取双侧人迎穴，施以捻转手法，捻转频率为每分钟120～160次，行针1min，每日针刺1次；模型组和正常组进行与针刺组相同时间、相同程度的捉抓。每天针刺前后测量收缩压和舒张压。针刺4周后，取胸主动脉，用酶联免疫法检测ROS含量，硝酸还原酶法检测NO含量，蛋白印迹法检测eNOS蛋白表达。[结果]针刺4周后SHR收缩压和舒张压均较针刺前降低，均低于模型组，其中以收缩压降低更为明显。SHR胸主动脉的ROS含量高于WKY，而NO含量和eNOS蛋白表达低于WKY（P<0.05），针刺后ROS含量明显降低，而NO含量明显升高（P<0.05），eNOS蛋白表达亦有升高趋势。[结论]针刺可降低SHR血压，其机制可能与降低ROS和提高NO/eNOS含量，从而提高机体抗氧化能力有关。

高血压；针刺；活性氧；一氧化氮；内皮型一氧化氮合酶

高血压病的发病机制及病理过程至今仍尚未完全阐明，近年来大量研究证明氧化应激在高血压病的发生和发展过程中起着重要的作用[1]。氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加或抗氧化清除能力降低，导致ROS在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。已有学者证实原发性高血压、高血压危象患者，体内血氧化应激标志物明显升高，内源性抗氧化物质显著低于血压正常者，并且与舒张性物质呈负相关[2]；自发性高血压大鼠（SHR）是与人类原发性高血压发病机制最接近的动物模型[3]，也存在着随血压升高，大鼠主动脉、心脏、肾脏的氧化应激标志物增高的事实[4]。针灸在降压方面疗效肯定[5]，前期研究也证实了针刺降压的有效性[6]，但针刺降压的机制研究较少，涉及到氧化应激机制更是鲜有报道。本研究观察针刺人迎穴对自发性高血压大鼠（SHR）血压的影响以及胸主动脉活性氮（ROS）和一氧化氮（NO）/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的变化，以期探讨针刺降压的抗氧化应激机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 ROS酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（加拿大HermesCriterion Biotechnology公司）、NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）、BCA蛋白定量测试盒（武汉博士德生物公司）、预染蛋白分子量标准Marker（碧云天生物技术研究所）、β-actin单克隆抗体（天津润泰科技生物有限公司）、大鼠抗羊一氧化氮合酶eNOS蛋白多克隆抗体（武汉博士德的生物有限公司）、辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金桥公司）、ECL显影试剂盒（Santa Cruz公司）、生理盐水等。

1.2 仪器 智能无创鼠尾动脉血压测量仪（日本软隆BP-98A）、瑞士Tecan Sunrice Remote酶标仪、日本岛津UV2501紫外分光光度计、凝胶成像系统（美国Bio-Rad Mini-Protein3 system）、电泳仪、湿转仪（北京六一仪器厂）。

1.3 实验动物及分组 雄性SHR20只，WKY 10只，16周龄，体质量190～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性喂养1周后，将20只SHR 大鼠（收缩压≥180mmHg，1mmHg=0.133 kPa）采用Excel工作表自动生成的随机数字表随机分为针刺组和模型组，每组10只。将10只WKY大鼠作为血压正常的正常组。

1.4 穴位选取及针刺方法 选取“人迎”为针刺穴位。根据人和大鼠解剖特点和人迎穴定位特点，以中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”作为参考，确定大鼠人迎穴定位：颈部三角区内，当胸骨舌骨肌与胸锁乳突肌上缘交点，约当颈总动脉分叉处，体表可触及搏动，当直刺时可见针柄随动脉搏动而上下振动。固定大鼠，暴露双侧颈部人迎穴部位，选用华佗牌0.3mm×40mm毫针直刺人迎穴，深度2～3mm，见针柄随动脉搏动而上下振动，为刺中穴位。施以捻转手法，捻转频率为每次120～160次，行针1min，以节拍器辅助，便于掌握捻转的频率和时间。针刺组每天上午针刺1次，每周针刺5 d，休息2 d，共治疗4周。模型组和正常组均不针刺，与人迎组在同一时间进行相同抓取刺激。

1.5 血压的测量 于每天针刺前和针刺后6 h，用动物智能无创血压测试仪测量各组大鼠的尾动脉收缩压和舒张压。具体使用方法：1）测压前确保动物室环境安静、温度适宜，打开血压仪器系统预热，压力值设为220mmHg。2）打开鼠袋，将鼠网放入保温筒，再将保温筒放入鼠袋，确保合适。3）抓取大鼠，动作轻柔的将待测大鼠置于鼠袋内，固定鼠袋，使尾巴暴露在外，将大鼠尾部穿过加压感应器，使加压感应器距尾根3～5 cm处。4）打开软件，待大鼠安静，尾动脉血管充分预热扩张，界面显示动态血压波形稳定后开始测量血压，连续测量2次，取平均值。前后两次血压值波动幅度不超过10%为度。

1.6 取材和指标检测 各组大鼠于治疗结束后，用10%水合氯醛按3.5mL/kg体质量的剂量麻醉大鼠，迅速开胸取胸主动脉，清除周围的结缔组织，放入冻存管中-80℃保存。检测时取出组织，匀浆，按照试剂盒说明书，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测ROS，硝酸还原酶法检测NO含量，蛋白质免疫印迹（Western Blotting）法测定eNOS表达。

1.7 统计方法 所得数据用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料用均值±标准差（±s）表示，符合正态的计量资料，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA)，两两比较时若方差齐者用LSD法，方差不齐者用Tamhane’ST2法；不符合正态分布的计量资料，组间比较采用多个独立样本比较的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠4周后血压变化 针刺前，针刺组和模型组的收缩压、舒张压均高于血压正常的WKY（P<0.05）。针刺4周后，正常组的收缩压和舒张压均稳定在正常范围内；模型组的收缩压和舒张压随周龄增长而升高；针刺组收缩压与模型组比较明显降低（P<0.05），而舒张压与模型组比较有降低的趋势，虽然无统计学差异，但由于SHR血压随周龄增加而升高，故针刺在一定程度上能够抑制SHR随周龄而升高的舒张压。若延长治疗周期，推测舒张压与模型组比较会出现统计学差异。见表1、表2。

表1 各组针刺前和4周后收缩压比较（±s）Tab.1 Comparison of thesystolic blood pressure changes beforeacupunctureand after 4weeks in each group(±s)

表1 各组针刺前和4周后收缩压比较（±s）Tab.1 Comparison of thesystolic blood pressure changes beforeacupunctureand after 4weeks in each group(±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

mmHg组别 动物数 针刺前收缩压 4周后收缩压针刺组 10 177.75±23.29* 169.91±17.07#模型组 10 181.10±18.10* 189.22±20.39*正常组 10 122.80±16.24 123.65±17.72

表2 各组针刺前和4周后舒张压比较（±s）Tab.2 Com parison of the diastolic blood pressure changes beforeacupuncture and after 4weeks in each group(±s)

表2 各组针刺前和4周后舒张压比较（±s）Tab.2 Com parison of the diastolic blood pressure changes beforeacupuncture and after 4weeks in each group(±s)

注：与正常组比较，*P<0.05。

mmHg组别 动物数 针刺前舒张压 4周后舒张压针刺组 10 128.89±16.43* 127.37±23.30模型组 10 125.90±16.20* 134.81±17.49*正常组 10 78.74±11.39 76.51±20.75

2.2 针刺对SHR胸主动脉ROS和NO含量的影响

模型组ROS含量明显高于正常组（P<0.05），而NO含量明显低于正常组（P<0.05）；针刺组ROS含量明显低于模型组（P<0.05），而NO含量明显高于模型组（P<0.05）。提示SHR体内ROS含量明显升高、NO含量明显降低，针刺有降低ROS、提高NO的作用。见表3。

表3 各组大鼠胸主动脉ROS、NO含量的比较（±s）Tab.3 Com parison of ROSand NO contents in thoracic aorta in each group(±s)

表3 各组大鼠胸主动脉ROS、NO含量的比较（±s）Tab.3 Com parison of ROSand NO contents in thoracic aorta in each group(±s)

注：与模型组比较，*P<0.05，与正常组比较，#P<0.05。

组别 动物数 ROS（U/mg） N O（μmol/g）针刺组 6 1.14±0.07* 114.18±53.19*模型组 6 1.72±0.09# 48.04±19.91#正常组 6 1.38±0.17 144.51±38.76

2.3 针刺对SHR大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达的影响 模型组大鼠胸主动脉eNOS蛋白含量较正常组偏低（P<0.05），针刺组eNOS蛋白表达虽较模型组无统计学差异（P>0.05），但仍较模型组有所升高。见图1、表4。提示SHR体内eNOS蛋白表达明显减少，针刺有提高其表达的趋势。

图1 eNOS蛋白表达Fig.1 Protein expression of eNOS

表4 各组胸主动脉eNOS的蛋白表达（±s）Tab.4 Com parison of the of protein expression about eNOS in thoracic aorta in each group（±s）

表4 各组胸主动脉eNOS的蛋白表达（±s）Tab.4 Com parison of the of protein expression about eNOS in thoracic aorta in each group（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05。

组别 动物数 灰度值 eNOS/β-actin针刺组 6 122.15±28.88 0.74±0.01模型组 6 104.50±17.94 0.58±0.04*正常组 6 161.58±36.69 0.93±0.28

3 讨论

本院石学敏院士创立了以人迎穴为主穴、有规范明确手法量学标准的针刺降压方法。针刺人迎穴有明确的量学要求，根据临床实践，人迎穴采用捻转补泻手法第二定义中的补法操作（施用小幅度、高频率捻转补法，捻转幅度小于90°；捻转频率为120～160 r/min）[7]。应用此针法降压在临床上取得了良好效果[6,8]。本研究显示，针刺可降低SHR随周龄而升高的血压，其中以收缩压降低更为显著。

氧化应激加速高血压病的发生发展，其作用的靶点是血管损害[9]。血管内皮细胞和平滑肌细胞在某些危险因素诱导下会产生大量的ROS，会导致血管内皮功能紊乱、破坏血管结构、加速动脉硬化，从而引起血压持续升高。O2-是ROS的主要来源，O2-本身具有缩血管功能，同时，在病理状态下，多种氧化/抗氧化酶的活性增强/减弱，O2-的产生速率大于被清除的速率，就会造成ROS的蓄积，另一方面，过多的O2-可以与NO结合生成氧化亚硝酸盐（ONOO-），使内皮衍生性的NO生物利用度下降[10]，引起血管收缩，血压升高。ROS参与高血压血管损害的病理机制主要表现在参与血管重构和损害血管内皮依赖性舒张功能这两个方面[11-12]。发生高血压等病理变化时，eNOS出现功能障碍，产生O2-，使eNOS合成的NO的生物利用度会明显降低，增加氧化应激，导致或加重内皮功能障碍，发生eNOS脱偶联现象[13-14]，其促进了高血压的发展和血管并发症的发生[15]。

NO是一种血管舒张因子，能迅速穿过生物膜，从内皮细胞扩散到血管平滑肌细胞后，通过激活鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷（cGMP）浓度增加，导致平滑肌细胞松弛，血管扩张，血压下降。血管系统中eNOS是NO的主要来源。研究发现原发性高血压病患者较正常人血清内的NO含量释放减少，在SHR大鼠主动脉中，NO生成减少，提示内源性NO减少，导致血管收缩，可能是血压持续升高的一个重要原因[16-17]。

本研究中，SHR胸主动脉中ROS含量升高、NO含量和eNOS蛋白表达减少，与血压正常的WKY比较有统计学差异（P<0.05）。针刺治疗后，胸主动脉ROS含量降低，NO含量升高（P<0.05），eNOS表达亦有升高趋势（P＞0.05）。研究结果提示SHR体内氧化与抗氧化关系失衡，使机体内ROS蓄积过多，同时eNOS表达量减少，降低了NO的合成能力。针刺降压的机制之一可能是通过减少ROS含量，提高NO/eNOS含量，从而提高机体的抗氧化应激能力，减轻血管内皮功能的损害，起到舒张血管作用，达到降压目的。

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Effectsofacupuncturing on spontaneously hypertensive ratsblood pressure and antihypertensivemechanism

LIU Jian1,GAOTing2,WAN Ji-wei2,LIYin-hong2,WANGMin3
（1.Acupuncture Institute,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Acupuncture Encephalopathy Key Research Laboratory of the State Administration of TraditionalChinesemedicine,Three-level Laboratory ofDoseeffect relationship of the State Administration of TraditionalChineseMedicine,Tianjin Acupuncture Key Laboratory,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China;3.Acupuncture Department,the FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe the effects of acupuncture on spontaneously hypertensive rat(SHR)blood pressure,ROSand NO/eNOS,and research the antihypertensivemechanism from the perspective of resistancing to oxidative stress.[Methods]To separate the SHRs into acupuncture group and model group random ly,WKYs as normal blood pressure controlled group.To acupuncture group,acupuncturewith the twirlingmanipulation,frequency 120～160 times/min,lasting 1min.Modelgroup and normalgroup were treated by the same crawl stimulation.The systolic pressure wasmeasured before and after the treatmentevery day.The blood pressure wasmeasured before and after the treatmentevery day.After 4 weeks of treatment,all the ratswere decapitated and get the thoracic aorta.The contentof ROSand NO wasmeasured by ELISA method and nitrate reductive enzymatic.The eNOS protein expresswasmeasured by Western blotting.[Results]After4 weeksacupuncture,the both systolic and diastolic blood pressure of SHRwere lower than before,and lower thanmodel.Among them,the systolic blood pressure lowering wasmore apparent.The content of ROS in SHR was higher than WKY,NO and eNOSwas lower(P<0.05).Afteracupuncture,the contentofROSwas lowerand NOwashigher(P<0.05),and eNOSprotein wasalso rising trend compared withmodelgroup.[Conclusion]Acupuncture can reduce SHR systolic and diastolic blood pressure and itsmechanismsmay be related to reduce the contentofROSand increase the contentofNO/eNOS,thus improve theantioxidantcapacity.

hypertension;acupuncture;reactive oxygen species;nitric oxide;endothelialnitric oxide synthase

R544.1

A

1672-1519（2015）08-0488-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.08.12

国家自然科学基金项目（81202738）；2011年度教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助；天津市应用基础与前沿技术研究计划（13JCZDJC31700）；天津市卫生局中医中西医结合科研项目（11036）。

刘 健（1974-），女，博士，副主任医师，研究方向为针刺治疗脑血管疾病的临床和基础研究。

2015-02-25）

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