正交试验法优选葛花异黄酮的提取工艺

王金凤，赵 楠，魏 颖，杨翠燕，王 芳，刘 丹（解放军208医院，吉林长春 130062）

・论著・

正交试验法优选葛花异黄酮的提取工艺

王金凤，赵 楠，魏 颖，杨翠燕，王 芳，刘 丹（解放军208医院，吉林长春 130062）

目的优选葛花异黄酮的提取工艺。方法乙醇回流提取葛花异黄酮，采用紫外分光光度（UV）法和高效液相色谱（HPLC）法测定葛花中总黄酮及鸢尾苷、鸢尾苷元含量。在对乙醇浓度、溶剂用量、提取时间等进行单因素考察基础上，选用L9（34）正交设计试验优选提取工艺。结果葛花异黄酮的最佳提取工艺为第1次加入12倍量70%乙醇提取90min，第2次加入10倍量70%乙醇提取60 m in。结论优选的葛花异黄酮提取工艺合理可行，能为实际生产提供参考。

葛花；鸢尾苷；鸢尾苷元；提取工艺；正交试验

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd）Ohw i的干燥花蕾。《神农本草经》记载葛花主要用于解酒醒脾，治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕呃吐酸、吐血和肠风下血等，是最具代表性的解酒药物。现代药学研究发现，葛花中含有13种异黄酮［1］，鸢尾苷和鸢尾苷元为其主要成分［2］。口服鸢尾苷经肠道细菌作用转化为鸢尾苷元而具有生物活性。鸢尾苷元具有保肝、降血糖、降血脂、抗炎、抗过敏和防治糖尿病并发症等多种生物活性［3-6］。本实验采用乙醇回流提取的方法，在单因素考察基础上，通过正交试验法优选葛花异黄酮提取工艺，为其开发应用奠定基础。

1 仪器与试药

葛花药材：2012年6月下旬采于吉林省临江市，取花蕾、花及其顶生20 cm以内的茎叶，自然阴干后，粉碎至60目。鸢尾苷、鸢尾苷元对照品（实验室自制20050817、20051208，纯度＞99.0%）。乙醇等化学试剂均为分析纯，北京化工厂生产。水为重蒸水。旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂），UV-3200S紫外可见分光光度仪（上海美谱达仪器有限公司），CP225D电子天平（德国赛多利斯股份公司）。

2 方法与结果

2.1 紫外分光光度法检测葛花异黄酮

2.1.1 溶液的制备 对照品溶液：精密称取鸢尾苷对照品4 mg，用70%乙醇定容于10 m l容量瓶中，摇匀，即得0.4 mg／m l鸢尾苷对照品储备液。精密量取鸢尾苷对照品储备液3 m l，用70%乙醇定容于50 m l容量瓶中，摇匀，得24μg／m l鸢尾苷对照品溶液。

供试品溶液：取干燥的葛花粗粉10 g，按照不同方法提取，冷却后70%乙醇定容于200 m l量瓶中，摇匀。精密量取0.5 m l，用70%乙醇定容于10 m l容量瓶中，摇匀。再精密量取0.5 m l置于10 m l容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.2 标准曲线的确立 测定波长的选择：取鸢尾苷对照品溶液3 m l，以70%乙醇为空白对照，在波长200～400 nm处进行扫描，结果在264 nm处有最大吸收，因此将测定波长确定为264 nm。

标准曲线的绘制：精密称取鸢尾苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、5.0和10.0 m l，置于10 m l容量瓶中，加70%乙醇定容，在264 nm处测定吸光度。以对照品溶液浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y＝0.081 8X＋0.015 2，r＝0.999 9，表明鸢尾苷在1.20～24.0μg／m l范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度实验 精密量取鸢尾苷对照品溶液3 m l，加70%乙醇定容至10 m l。以70%乙醇为空白对照，在264 nm处连续测定5次，测得吸光度的相对偏差（RSD）为0.11%。表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性实验 取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、24 h，测定其吸光度。RSD＝0.46%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.5 重复性考察 取同一次定容后提取液5份，按供试品溶液制备方法制备，依次测定吸光度。RSD＝1.87%，表明该方法重复性较好。

2.1.6 加样回收率实验 精密称取已知异黄酮含量的葛花提取液9份，分别加入不同体积的鸢尾苷对照品溶液，加70%乙醇定容至10 m l，摇匀，以70%乙醇为空白对照，在264 nm处测定吸光度。代入标准曲线求得总黄酮含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.2 HPLC法检测葛花异黄酮 按照本实验室建立的方法［7］，色谱条件：美国Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：甲醇-乙腈-水（2∶1∶2），流速1.0 m l／min；检测波长264 nm，柱温为室温。回归方程分别为Y＝44 122X＋5 039.1和Y＝61 603X－6 210.4，r＝0.999 8和r＝0.999 9。鸢尾苷、鸢尾苷元分别在2.0～120.0μg／m l、0.8～80.0μg／m l范围内呈线性关系，代入标准曲线求供试品溶液中的鸢尾苷和鸢尾苷元含量，将鸢尾苷按等摩尔浓度换算成苷元含量，计算总鸢尾苷元含量。即供试品中总鸢尾苷元含量（mg）＝鸢尾苷含量（mg）÷鸢尾苷相对分子质量（462）×鸢尾苷元分子量（300）。对照品及供试品色谱图见图1。

图1 对照品及供试品HPLC色谱图

2.3 提取工艺优选

2.3.1 单因素实验 提取次数的考察：精密称定干燥葛花粗粉10 g，加入14倍量70%乙醇（V／W），回流提取3次，每次1 h。按供试品溶液制备项下操作，测定吸光度。结果第1次70%乙醇回流提取，可提取异黄酮总量的77.9%，第2次提取14.2%，第3次仅有7.8%。2次提取可达90%以上，因此正交试验设定为提取2次。

溶媒浓度的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密称定，分别加入14倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇，回流提取1次，每次提取时间1 h。按供试品溶液制备项下操作，测定吸光度。结果发现从50%～70%乙醇提取异黄酮总量随乙醇浓度的增加而增加，80%、90%乙醇提取量并未增加，得出70%乙醇的提取效果最好，因此选择60%、70%、80%作为正交试验的考察因素，进一步考察其对提取效果的影响。

提取时间的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密称定，加入14倍量70%乙醇，分别回流提取30、50、60、90、120 min。按供试品溶液制备项下操作，测定吸光度。结果显示，从30～120 min提取量逐渐上升，因此选择30、60、90和120min作为正交试验的考察因素，进一步考察其对提取效果的影响。

溶媒用量的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密称定，分别加入8、12、14、16、20倍量70%乙醇，回流提取60 m in。按供试品溶液制备项下操作，测定吸光度。结果发现，从8～14倍量溶煤提取异黄酮总量随溶媒用量的增加逐渐上升，以14倍量提取效果最佳。但溶煤用量进一步增加，提取量并未随之增加，因此选择10、12、14倍量作为正交试验的考察因素，进一步考察对提取效果的影响。

2.3.2 正交试验设计与结果分析 根据单因素实验，选择乙醇浓度（A）、提取时间（B）、溶媒用量（C）为考察因素，以HPLC法检测鸢尾苷和鸢尾苷元含量为指标，优选回流提取工艺，采用L9（34）正交设计表进行实验。因素水平见表2，正交试验结果见表3。

表2 乙醇回流提取葛花异黄酮因素水平

根据极差R分析结果得知，对总黄酮提取率影响的主要因素顺序为：A＞C＞B，即乙醇浓度＞溶媒用量＞提取时间，把D（空白）作为误差列进行分析。由表4方差分析结果可知，A因素对提取效果的影响有显著意义（P＜0.05），而B因素和C因素在经过单因素实验后，无显著意义。考虑到实际生产过程中，减少溶媒用量有利于节约资源、降低成本。因此，A2B2C2可作为最佳提取工艺，即第1次加入12倍量70%乙醇提取90 min，第2次加入10倍量70%乙醇提取60 m in。

2.3.3 工艺验证实验 为进一步验证正交试验结果，取葛花粗粉250 g，加入70%乙醇3 000 m l回流提取90 m in，滤过，收集滤液。残渣加入70%乙醇2 500 m l回流提取60 min，滤过，收集滤液。合并两次滤液，测定体积后按“2.1.1”项下操作，按上述色谱条件测定鸢尾苷和鸢尾苷元的含量，重复5次。结果见表5。结果表明，在最佳提取条件下提取的鸢尾苷和鸢尾苷元含量高且均较稳定。

表5 最佳提取工艺验证

3 讨论

本实验通过正交设计法优选出葛花的最佳提取工艺为乙醇浓度、乙醇用量、提取时间。按最佳提取条件进行5次平行的验证实验，稳定性较理想，适合于工业生产，且该工艺操作简单，有效成分含量较高，提取工艺合理可行。

［1］ 尹俊亭，仲英，孙敬勇，等.葛花的研究进展［J］.中草药，2005；36（12）：1905-1906.

［2］ Park EK，Shin YW，Lee HU，etal.Passive cutaneous anaphylaxis-inhibitory action of tectorigenin，a metabolite of tectoridin by intestinalmicroflora［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（7）：1099-1102.

［3］ Lee HW，Choo MK，Bae EA，etal.Beta-glucuronidase inhibitor tectorigenin isolated from the flower of Pueraria thunbergiana p rotects carbon tetrachloride-induced liver injury［J］.Liver Int，2003，23（4）：221-226.

［4］ Lee HU，Bae EA，Kim DH.Hepatoprotective effect of tectoridin and tectorigenin on tert-butyl hyperoxide-induced liver injury［J］.JPharmacol Sci，2005，97：541-544.

［5］ M oon H I，Jung JC，Lee HK.A ldose reductase inhibitory effect by tectorigenin derivatives from Viola hondoensis［J］.Bioorg M ed Chem，2006，14（22）：7592-7594.

［6］ 王金凤，杨翠燕，张艳萍，等.鸢尾苷对高脂血症大鼠血清脂质的影响［J］.基础医学与临床，2010，30（9）：925-929.

［7］ 赵 楠，刘 丹，王艳萍，等。HPLC法测定葛花中鸢尾苷和鸢尾苷元含量［J］.药学实践杂志，2012，30（3）：226-228.

Optim ized extraction technology of flos Puerariae lobata isoflavone using orthogonal test

WANG Jinfeng，ZHAO Nan，WEIYing，YANGCuiyan，WANG Fang，LIU Dan（No.208 Hospitalof PLA，Changchun 130062，China）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of flos Puerariae lobata isoflavone.MethodsThe flos Puerariae lobata isoflavone was distilled by ethanol circum fluence.Total flavonoids，tectoridin and tectorigenin extracted from Puerariae using the UV and HPLC spectromertry methods were taken as evaluation indexes.Extraction technology was optimized w ith L9（34）orthogonal teston the baseof singleobservation of ethanol concentration，solvent dosageand distilling time.ResultsThe bestextraction technology of flos Puerariae lobata isoflavonewas：to add 12 times the amountof 70%ethanol for 90 minutes for the first time，and 10 times theamountof 70%ethanol for 60minutes for the second time.ConclusionThe optim ized extraction process of flos Puerariae lobata isoflavone is reasonable and feasible，and it can offer reference to actual production.

flos Puerariae lobata；tectoridin；tectorigenin；extract technology；orthogonal test

R284.2

A

1006-0111（2015）04-0338-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.013

2013-09-29

2014-04-15［本文编辑］李睿旻

吉林省科技发展计划项目（20090919，20130101 145JC）

王金凤，主任医师.研究方向：心血管疾病的新药研发.E-mail：13944927368＠139.com