手术创伤对老龄大鼠认知功能及海马ApoE表达影响

王威，丁明，宗波，迟蕾

(1 潍坊医学院麻醉学系，山东 潍坊 261053； 2 中国人民解放军第89医院麻醉科； 3 中国人民解放军第89医院普外科)



手术创伤对老龄大鼠认知功能及海马ApoE表达影响

王威1，丁明2，宗波3，迟蕾1

(1 潍坊医学院麻醉学系，山东 潍坊 261053； 2 中国人民解放军第89医院麻醉科； 3 中国人民解放军第89医院普外科)

目的 探讨手术创伤对老龄大鼠认知功能及海马CA1区载脂蛋白E (ApoE)表达的影响。方法将36只Wistar大鼠按随机数字表法分为3组，每组12只。正常对照组(C组)腹腔注射生理盐水；麻醉组(A组)腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，不进行手术；手术创伤组(S组)腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，待翻正反射消失后行脾切除手术。各组于术前1～5 d、术后1～4 d进行Morris水迷宫实验，测定认知功能。测试结束后立即处死大鼠，取脑组织，采用免疫组织化学法，检测海马CA1区ApoE的表达。结果 与术前比较，A组术后1 d、S组术后1～3 d逃避潜伏期延长(F=46.108、82.003,q=2.771～14.627,P<0.05)；与C组比较，A组术后1 d、S组术后1～3 d逃避潜伏期延长(F=26.930～119.360,q=6.578～15.450,P<0.05)。与C组比较，S组术后4 d原平台象限停留时间缩短(F=32.021,q=7.209,P<0.05)，穿越原平台次数减少(F=16.026,q=5.170,P<0.05)，海马CA1区ApoE免疫反应阳性细胞增多(F=9.148,q=4.117,P<0.05)。结论 手术创伤可导致老龄大鼠认知功能减退，其机制可能与海马中ApoE表达上调有关。

外科手术；创伤和损伤；认知；海马；载脂蛋白E类；大鼠

术后认知功能障碍(POCD)是指麻醉手术后病人持续存在的记忆力、抽象思维、定向力障碍，同时伴有社会活动能力的减退，即术后人格、社交能力、认知能力和技巧的变化。自从BEDFORD[1]首次报道老年病人发生POCD以来，POCD的研究已有50余年，但其原因及发生机制仍不清楚。随着人口老龄化的不断加剧，老年病人POCD越来越受到重视，POCD增加病人住院时间和医疗费用，并导致病人社会活动能力减退，严重影响生活质量[2]。载脂蛋白E(ApoE)是一种含精氨酸较多的多态性糖蛋白[3],在神经系统的正常生长过程及损伤后修复中发挥作用[4]。本研究拟评价脾切除手术后大鼠认知功能与ApoE表达的变化，为研究POCD的发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1动物分组及处理

雄性Wistar大鼠36只，18～20月龄，体质量500～600 g，由山东鲁抗动物药业有限公司提供。大鼠适应性饲养1周，自由摄食饮水。实验前禁食12 h，自由饮水。按随机数字表法，将大鼠随机分为3组，每组12只。正常对照组(C组)腹腔注射生理盐水2.5 mL/kg；麻醉组(A组)腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠2.5 mL/kg麻醉；手术创伤组(S组)腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠2.5 mL/kg，待翻正反射消失后右侧卧位固定，剃毛，皮肤消毒，在肋缘下和脊柱旁各1 cm交点处作1.5～2.0 cm竖切口，进入腹腔游离脾脏，在脾蒂远端根部用3号丝线结扎脾动静脉，完全摘除脾脏并确定无副脾残留,彻底止血后用碘附消毒切口，0号线逐层关腹，术毕切口周围注射布比卡因10 mg/kg局部镇痛。

1.2认知功能测试

应用Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)实验检测大鼠认知功能。在实验开始前1 d对大鼠进行训练和筛选，将大鼠小心放入水迷宫中自由游泳，让其适应实验环境，淘汰有显著运动障碍和经过反复训练仍然找不到平台的大鼠。各组大鼠于术前5 d开始行定位航行实验，连续5 d，第5天的成绩作为术前测试结果。术后1 d继续进行定位航行实验，连续3 d。每天于相同时间点进行测试，依次从各象限池壁中点将大鼠面向池壁放入水中，从入水到找到隐蔽平台的时间即为本次逃避潜伏期；在平台停留10 s后休息15 min，再将其从另一象限放入水中找寻平台；若120 s内未找到平台则将其引导至平台上，时间记录为120 s。每只大鼠取4个象限平均值作为当天的测试结果。空间探索实验：术后4 d，将平台撤除，从与平台相应的象限放入大鼠，记录其120 s内在原平台象限停留时间及穿过原平台次数。

1.3海马CA1区ApoE表达水平的测定

认知功能测试完成后，各组随机取3只大鼠，腹腔注射20 g/L水合氯醛2.5 mL/kg，待翻正反射消失后剪开胸腹充分暴露心脏和肝脏，迅速将导管经左心室插入主动脉，丝线固定导管后剪开右心耳。先以约200 mL生理盐水快速灌注，至肝脏完全变白，更换40 g/L的多聚甲醛继续灌注30 min，断头取脑组织，置40 g/L的多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机冠状切片，片厚5 μm。采用免疫组织化学SP法染色测定海马CA1区ApoE的表达水平。在Leica DM-1000型光学显微镜下拍摄，每例标本选取5张切片，在每张切片上随机选取3个不重复的视野，采用Imagepro plus图像处理系统，测出每个视野下阳性细胞的个数，取其

平均值。

1.4统计学处理

2 结 果

2.1Morris水迷宫实验

与术前相比较,A组术后1 d、S组术后1～3 d逃避潜伏期延长(F=46.108、82.003,q=2.771～14.627,P<0.05)，C组差异无统计学意义(P>0.05)；与C组比较，A组术后1 d、S组术后1～3 d逃避潜伏期延长(F=26.930～119.360,q=6.578～15.450,P<0.05)。与C组比较，S组术后4 d原平台象限停留时间缩短(F=32.021,q=7.209,P<0.05)，穿越原平台次数减少(F=16.026,q=5.170,P<0.05)。见表1、2。

2.2海马组织ApoE表达

光镜下见细胞质或核膜上染色呈棕褐色者为ApoE免疫反应阳性细胞。S组海马CA1区ApoE免疫反应阳性的细胞较C组增多(F=9.148,q=4.117,P<0.05)，而A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间水迷宫实验逃避潜伏期的比较

表2 各组大鼠原平台象限停留时间、穿过原平台次数及海马CA1区ApoE表达的比较

3 讨 论

大量研究证实，老龄是惟一明确的POCD危险因素[5-6]，年龄>65岁老年病人POCD发病率是年轻人6～10倍[7]，故本文以老龄大鼠为研究对象。

为避免感染因素对实验结果的影响，术中严格无菌操作，并在文献报道的大鼠脾切除方法的基础上[8]，对切口位置进行改良,由原来的仰卧位在肋缘下腹中线偏左1 cm处切口，改良为右侧卧位于肋缘下和脊柱旁各1 cm交点处做1.5～2.0 cm竖切口。改良后的方法既可使脾脏容易暴露，又便于水迷宫测试时用防水贴膜贴附和每天切口的消毒。

Morris水迷宫实验能较客观地评价空间学习记忆能力，是经典的行为学研究方法[9]。为排除时间、光照、温度等因素对实验结果的影响，本研究每天于相同时间段进行实验，保持光照和水温的恒定。随着训练天数的增加，大鼠的逃避潜伏期时间逐渐缩短，说明大鼠有一个学习和记忆的过程。与术前和对照组相比较，手术组术后1～3 d逃避潜伏期时间延长、原平台象限停留时间缩短、穿过原平台次数减少，说明手术创伤影响了大鼠的认知能力；麻醉组术后1 d的逃避潜伏期时间延长，说明戊巴比妥钠麻醉对大鼠的认知功能有一过性的抑制作用，可能是戊巴比妥钠在体内未代谢完产生的影响[10]。

手术创伤后所致的急性应激可导致神经胶质细胞，尤其是星形细胞出现功能紊乱，引起不良的神经元-胶质细胞相互作用，致神经元损害[11]。中枢神经系统中的ApoE主要产生于星形胶质细胞[12]，参与脑组织中脂质代谢及神经元网络维持和神经细胞的修复再生。目前，手术创伤后导致ApoE的表达增多原因尚不清楚，可能是由于手术应激致神经元受损，ApoE在损伤的神经元周围大量聚集修复阻碍了神经传导通路有关。

综上所述，手术创伤可影响老龄大鼠的认知功能，其机制可能与海马组织中ApoE表达上调有关。

[1] BEDFORD P D. Adverse cerebral effects of anesthesia on old people[J]. Lancet, 1955,269(6684):259-263.

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[3] SHELBURNE F, QUARFORDT S H. A new apoprotein of human plasma very low density lipoproteins[J]. J Chem, 1974,249(5):1428-1433.

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[7] SILVERSTEIN J H, TIMBERGER M, REICH D L, et al. Central nervous systerm dysfunction after noncardiac surgery and anesthesia in the elderly[J]. Anesthesiology, 2007,106(3):622-628.

[8] 徐静,万燕杰,曾因明. 脾切除术对大鼠空间学习记忆能力的影响[J]. 中华麻醉学杂志, 2006,26(2):144-147.

[9] POUZET B, ZHANG W N, FELDON J, et al. Hippocampal lesioned rats are able to learn a spatial position using non-spatial strategies[J]. Behavioural Brain Research, 2002,133(2):279-291.

[10]王红梅,耿德勤,谭迎春,等. 麻醉与手术创伤对不同月龄大鼠认知功能的影响[J]. 中国行为医学科学, 2003,12(6):17-18.

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[12]KOOB A O, PAULINO A D, MASLIAH E. GFAP reactivity, apolipoprotein E redistribution and cholesterol reduction in human astrocytes treated with alpha-synuclein[J]. Neuroscience Letters, 2010,469(1):11-14.

(本文编辑 马伟平)

EFFECTS OF SURGICAL TRAUMA ON COGNITIVE FUNCTION AND EXPRESSION OF APOE IN HIPPOCAMPUS OF AGED RATS

WANGWei,DINGMing,ZONGBo,CHILei

(Department of Anesthesiology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo explore the effects of surgical trauma on cognitive function and expression of Apolipoprotein E (ApoE) in the hippocampal CA1 area of aged rats.MethodsThirty-sixWistarrats were evenly randomized to three groups as control group (Group C), anesthesia group (Group A) and surgical trauma group (Group S). The rats in the group C were given intraperitoneal injection of normal saline, those in group A were anesthetized using intraperitoneal injection of pentobarbital sodium, no operation was performed, for those in group S, intraperitoneal pentobarbital-sodium-anesthesia was given and a splenectomy performed. Morris water maze experiment was carried out to assay cognition function 1-5 days before and 1-4 days after surgery. The rats were sacrificed upon completion of the test, the brain tissues were taken for detection of ApoE expression in hippocampal CA1 area using immunohistochemical method.ResultsCompared with pre-operation, the escape latent period was increased one day after surgery in group A, and one to three days in group S (F=46.108,82.003;q=2.771-14.627;P<0.05); Compared with group C, the escape latent period in group A increased one day after surgery, and that in group S increased one to three days after (F=26.930-119.360,q=6.578-15.450,P<0.05). A comparison between group C and group S showed that, four days after surgery, the period of rat staying in the pristine quadrant in group S shortened (F=32.021,q=7.209,P<0.05), the number of times traversing terrace decreased (F=16.026,q=5.170,P<0.05), and the number of positive ApoE immunoreactive cells in hippocampal CA1 area increased (F=9.148,q=4.117,P<0.05).ConclusionSurgical trauma may result in cognitive dysfunction in aged rats, its mechanism is likely to be related with up-regulation of ApoE expression in hippocampus.

surgical procedures, operative; wounds and injuries; cognition; hippocampus; apolipoproteins E; rats

2014-11-17;

2015-02-15

王威(1987-)，男，硕士研究生。

丁明(1966-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师。

R619.5

A

1008-0341(2015)03-0300-03