氯胺酮诱导原代培养大鼠皮质神经元凋亡

李建立，吴红海，于 洋，薛 改，侯艳宁*

(1.河北省人民医院 麻醉科，河北 石家庄050051;2.中国人民解放军白求恩国际和平医院 药剂科，河北 石家庄050082)

发育期大鼠反复使用氯胺酮可导致大脑神经细胞的大量凋亡，影响幼鼠成年后的学习记忆功能[1-2]。因此研究氯胺酮对发育期大脑的影响具有重要的临床意义。本研究观察氯胺酮对发育期皮质神经元凋亡的影响并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物:清洁级新生24 h 内SD大鼠(河北省实验动物中心，合格证号:1306107)。

1.1.2 主要试剂与药品:氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司)，DMEM、Neurobasal-A、胎牛血清和B27 (Gibco 公司)，阿糖胞苷(浙江海正药业)，MTT、Hoechst 33258 荧光染料和胰蛋白酶(Solarbio 公司)，多聚赖氨酸(Sigma-Aldrich 公司)，TUNEL(罗氏公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮质神经元原代培养:参照文献[3]行大鼠皮质神经元的原代培养，体外培养7 d的神经元用于实验。

1.2.2 实验分组与药物处理:体外培养7 d的皮质神经元加入不同浓度的氯胺酮处理培养24 h，或100 μmol/L的氯胺酮处理皮质神经元6、12、24 和48 h，不加氯胺酮的对照组或100 μmol/L 氯胺酮培养24 h，观察氯胺酮对发育期皮质神经元的损伤作用。

1.2.3 观察指标:MTT法检测皮质神经元存活率，Hoechst33258 染色和TUNEL法检测皮质神经元凋亡，Western blot 法测定pGSK3β 蛋白表达。

2 结果

2.1 不同浓度氯胺酮对皮质神经元存活率的影响:神经元存活率随氯胺酮浓度的增加逐渐下降，其中100 和1 000 μmol/L的氯胺酮使神经元存活率明显下降，分别为对照组的58.2%(P＜0.01)和31.4%(P＜0.01)(图1)。

图1 不同浓度氯胺酮对原代培养皮质神经元存活率的影响Fig1 Effect of different concentrations of ketamine on viability of primary cultured cortical neurons(±s，n=6)

2.2 氯胺酮不同作用时间对原代培养皮质神经元存活率的影响:皮质神经元随氯胺酮处理时间延长存活率逐渐降低，其中处理12 h 神经元存活率为对照组的84.1%(P＜0.05)，处理24 h为57.6% (P＜0.01)，处理48 h 为43.6%(P＜0.01)(图2)。

图2 氯胺酮不同作用时间对原代培养皮质神经元存活率的影响Fig2 Effect of different incubation time with ketamine on viability of primary cultured cortical neurons(±s，n=6)

2.3 TUNEL法检测氯胺酮对皮质神经元凋亡的影响:氯胺酮组TUNEL阳性神经元为46.3%±5.2%，显著高于对照组9.2%±1.3%(P＜0.01)(图3)。

图3 氯胺酮对皮质神经元凋亡的影响Fig3 Effect of ketamine on neuroapoptosis of primary cultured cortical neurons using TUNEL assay(±s，n=5，×400)

2.4 Hoechst33258 核荧光染色法观察氯胺酮对原代培养皮质神经元凋亡的影响:氯胺酮组皮质神经元染色质高度凝聚、边缘化，细胞核甚至裂解为碎块，有大量凋亡细胞呈亮蓝色(45.8%±3.4%)，显著高于对照组(7.8%±2.2%)(P＜0.01)(图4)。

2.5 氯胺酮对皮质神经元pGSK-3β水平的影响:氯胺酮组皮质神经元pGSK-3β水平为0.71±0.05，显著低于对照组1.12±0.03(P＜0.01)(图5)。

图4 Hoechst33258 染色检测氯胺酮对皮质神经元凋亡的影响Fig4 Effect of ketamine on neuroapoptosis of primary cultured cortical neurons using Hoechst33258 dying(±s，n=5，×400)

图5 氯胺酮对皮质神经元pGSK-3β水平的影响Fig5 Effect of ketamine on the expression of pGSK-3β(±s，n=3)

3 讨论

本研究采用多种方法研究氯胺酮对原代培养皮质神经元的损伤作用。MTT 结果表明氯胺酮对存活率的影响具有剂量依赖性，1 μmol/L 氯胺酮在本实验条件下未见对神经元存活率产生影响，10 μmol/L 氯胺酮可抑制神经元的存活率(大约20%)，100 及1 000 μmol/L 氯胺酮可显著抑制神经元存活率。以往研究显示10 μmol/L 氯胺酮可显著抑制神经元的存活率(大约50%)[4]。此差异的产生可能与细胞培养方法、神经元发育阶段的差别有关。但对于较高浓度的氯胺酮对神经元的存活率影响更为明显，大多数研究结果是一致的[3-4]。另外本研究发现氯胺酮对神经元存活率的影响具有时间依赖性，随氯胺酮处理时间的延长，存活率逐渐下降，氯胺酮处理神经元24、48 h 会引起神经元存活率的显著下降。本实验应用Hoechst33258 染色和TUNEL 两种方法进一步证实了氯胺酮可诱导皮质神经元凋亡。

关于氯胺酮导致发育期皮质神经元损伤的机制，目前还不是非常明确，可能与氯胺酮导致NMDAR1的代偿性上调有关[4]。GSK3β 作为一种蛋白激酶在大脑中的表达尤为丰富，在神经元发育和神经细胞信号通路传导中发挥着十分重要的作用。氯胺酮诱导发育期大鼠大脑神经细胞凋亡与pGSK3β蛋白水平下降有关[5]。本研究也发现氯胺酮在诱导原代培养皮质神经元凋亡时伴随神经元pGSK3β 蛋白水平的下降，因此推理氯胺酮诱导皮质神经元凋亡可能与pGSK3β蛋白水平的下降有关。

综上所述，氯胺酮可剂量与时间依赖性诱导原代培养皮质神经元的凋亡，其机制可能与氯胺酮引起皮质神经元pGSK3β 蛋白水平的下降有关。

[1]Li J，Wang B，Wu H，et al.17beta-estradiol attenuates ketamiine-induced neuroapoptosis and persistent cognitive deficits in the developing brain[J].Brain Res，2014，1593:30-39.

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[5]Liu JR，Baek C，Han XH，et al.Role of glycogen synthase kinase-3beta in ketamine-induced developmental neuroapoptosis in rats[J].Br J Anaesth，2013，110:3-9.