持续缓慢放松止血带对肢体缺血再灌注损伤的保护作用

郭俊艳，皮红英，王建荣

长时间应用止血带后，肢体局部血液循环中断，止血带下及远端组织会发生缺血性损伤，而一旦放松止血带使血液循环恢复后，缺血组织则会发生涉及局部组织及全身多器官的再灌注损伤。传统观点认为减少缺血时间是降低损伤程度的唯一重要的干预措施，然而现在已清楚认识到缺血组织再灌注后引发的一系列复杂反应使组织细胞损伤持续存在并加重［1］。因此如何有效地防治肢体缺血再灌注损伤，降低肢体的伤残率和全身性损害是目前研究的重要领域。有文献报道，临床四肢手术应用止血带后，采用分次缓慢放气可减缓血压下降、减轻心率变化程度以及预防止血带休克的发生［2］。但这种方法是否有利于减轻止血带放松后所继发的缺血再灌注损伤尚未见报道，因此，本研究参考既往文献报道的分次缓慢放气的干预方法，通过动物实验观察对减轻组织再灌注损伤的作用，为临床防治止血带损伤提供方法支持及理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选择健康比格犬18只，雌雄不拘，体重10.0kg～12.0kg（11.5kg±1.3kg）。由军事医学科学院实验动物中心提供，为清洁级动物。

1.2 实验方法 比格犬实验前12h禁食，可自由进水，实验前0.5h置于手术室，手术室内温度为20℃左右。经耳缘静脉推注3%戊巴比妥钠（1g/kg）麻醉，麻醉成功后仰卧位固定于手术台上，右前肢腋前区及右后肢局部脱毛，手术分离右股动脉、股静脉，暴露右肱动脉。将TS402双通道血流仪探头钳夹于肱动脉处以监测动脉血流量，BLF21激光多普勒血流探针经皮插入右前肢远端皮下组织以监测远端组织血流量，股动脉插管并以肝素抗凝，以实时监测血压。将18只比格犬随机分为3组，每组6只。假手术组（S组）仅暴露右前肢肱动脉而不阻断动脉血流；快速放松组（RR组）采用德国VBM280OELC电动止血仪，止血袖带缚扎于犬右前肢，缓慢加压充气，经TS402双通道血流仪监测动脉血流量为0时停止充气，并持续阻断动脉血流3h。随后，快速放松止血带，即按压电动止血仪放气按钮，瞬间快速放松袖带内气体，恢复肢体血流灌注。持续缓慢放松组（SR组）阻断肱动脉血流3h后（方法同RR组），给予持续缓慢放松充气止血带，即缓慢旋转电动止血仪气压按钮，第1分钟放松1/2充气压力，第2分钟放松余下的1/2压力，第3分钟放松剩余压力，恢复肢体血流灌注。所有动物均予40mL/kg生理盐水进行液体复苏并保温至全身麻醉苏醒。

1.3 标本采集与处理

1.3.1 血标本的采集与处理 各组分别于阻断3h及放松3h、6h、24h于右股静脉穿刺取血约5mL，以3 500r/min离心10min，分离血清后装入Eppendorf管置于－70℃超低温冰箱中保存以备检测各项指标。S组以对应时间点为采血时间。

1.3.2 组织标本的采集与处理 各组分别于阻断3 h、放松3h依次于右前肢内侧纵行切开皮肤，游离皮肤及皮下组织，切取250mg肌组织放入液氮中冻存备用；取250mg肌组织置于10%甲醛液体中保存，常规石蜡包埋和切片（4μm厚），以备组织学检查；另取一块肌组织放于装有电镜固定液的小瓶内，－4℃冰箱保存。

1.4 观察及检测指标

1.4.1 血液循环指标的观察 于放松止血带后1 min、2min、5min、10min、15min 5个时间点观察并记录动物收缩压、舒张压、平均动脉压，以及缚扎止血带一侧肢体的肱动脉血流量和远端组织血流量。

1.4.2 骨骼肌丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测定 取出液氮冻存的组织标本100mg，用4℃生理盐水洗去血污，每项测定称取1.0g湿组织，加入0.2mol/L的缓冲液5mL，pH 7.3，用组织匀浆器在低温下研磨成匀浆，然后以10 000r/min离心20 min，取上清液。再分别采用相应试剂盒进行检测，所有步骤严格按试剂盒要求。操作结束后分别采用紫外分光光度法、半自动生化分析仪及酶标仪检测并计算MDA和SOD含量。

1.4.3 血清乳酸脱氢酶（LDH）、内皮素－1（ET－1）测定 将血清从－70℃超低温冰箱中取出，置于37℃恒温水浴锅内解冻，待解冻后取出血清加入检测试剂，采用全自动生化分析仪检测LDH、LDH含量。

1.4.4 组织病理学染色及电镜标本制作 ①电镜标本的制作方法：3%戊二醛浸泡2h，将标本切成约1 mm×1mm×1mm组织块，然后用缓冲液反复洗涤2 h～3h，再加入1%锇酸固定2h，经缓冲液冲洗3次，每次15min，各级乙醇充分脱水，环氧树脂包埋、超薄切片机切片，铀铅染色。透射电镜下观察、摄片。图片采用图像分析系统测量、分析。②组织病理学染色标本的制作方法：将所取组织标本放入10%甲醛溶液中固定24h后，经常规酒精脱水、石蜡包埋，制成5μm切片，行常规苏木精－伊红（HE）染色。

1.5 统计学处理 应用SSPS 13.0统计软件包进行分析处理，所得数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验比较两组间差别，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注后血液循环的变化

2.1.1 动脉血流量的变化 放松止血带后，RR组和SR组动脉血流量及组织血流量迅速增加，1min即达峰值，显著高于S组（P＜0.01）。RR组动脉血流量波动较大，1min时为（46.00±3.74）mL/min，2min时迅速下降至（12.67±1.75）mL/min，而SR组1min时动脉血流量为（30.17±2.23）mL/min，2min时降至（18.67±3.33）mL/min，其变化程度明显小于 RR组（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组放松后不同时间点动脉血流量的变化情况（n＝6，±s） mL/min

表1 各组放松后不同时间点动脉血流量的变化情况（n＝6，±s） mL/min

1min 2min 5min 10min 15min S组 23.33±2.58 23.17±1.47 24.23±2.73 24.00±3.5组别2 23.35±2.88 RR组 46.00±3.742） 12.67±1.752） 20.67±3.081） 24.00±4.29 25.33±3.62 SR组 30.17±2.232）3） 18.67±3.333） 21.56±3.14 23.41±2.34 23.53±2.25与S组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与RR组比较，3）P＜0.01。

2.1.2 组织血流量的变化 RR组在放松1min时组织血流量为（1 095.00±292.25）BPU/min，而SR组为（630.00±104.64）BPU/min，两组比较，SR组明显低于RR组（P＜0.01。两组组织血流量在放松1min达到峰值后迅速下降，直至放松10min才逐渐恢复，与S组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但SR组下降的幅度明显低于RR组，尤其在2min和5min时差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组放松后不同时间点组织血流量的变化情况（n＝6，±s） BPU/min

表2 各组放松后不同时间点组织血流量的变化情况（n＝6，±s） BPU/min

1min 2min 5min 10min 15min S组 293.33±66.53 304.67±63.14组别315.00±72.04 323.33±92.66 296.67±61.54 RR组 1 095.00±292.251） 836.67±118.051） 610.00±105.301） 433.75±95.21 340.33±66.60 SR组 630.00±104.643） 536.67±101.723） 485.00±81.922） 368.33±92.61 341.67±75.48与S组比较，1）P＜0.01；与RR组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

2.1.3 平均动脉压及心率的变化 放松止血带后，RR组和SR组平均动脉压明显降低，至5min时达最低 值，RR组为（104.33±4.25）mmHg（1mmHg＝0.133kPa），SR组为（110.50±4.47）mmHg，显著低于S组（P＜0.05或P＜0.01）。两组心率则明显增快，放松5min时达峰值，RR组为（196.17±8.26）/min，SR组为（1 8 5.8 3±7.2）/min，显著高于S组（P＜0.05）。两组比较，SR组平均动脉压明显高于RR组，尤其在放松2min、5min时差异有统计学意义（P＜0.05）；SR组心率的变化程度也明显小于RR组，在放松5 min时差异有统计学意义（P＜0.05）。两组平均动脉压和心率放松10min时逐渐恢复。详见表3、表4。

表3 各组放松后不同时间点平均动脉压的变化情况（n＝6，±s） mmHg

表3 各组放松后不同时间点平均动脉压的变化情况（n＝6，±s） mmHg

1min 2min 5min 10min 15min S组 119.83±3.97 118.79±6.15 118.00±5.28 118.67组别±5.23 119.74±5.56 RR组 114.83±2.401） 108.33±3.832） 104.33±4.252） 114.33±5.24 116.00±6.39 SR组 116.33±3.01 114.00±3.411）3） 110.50±4.471）3） 113.83±1.72 115.33±5.16与S组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与RR组比较，3）P＜0.05。

表4 各组放松后不同时间点心率的变化情况（n＝6，x±s） /min

2.2 缺血再灌注后骨骼肌组织MDA、SOD变化

2.2.1 MDA的变化 与S组比较，RR组和SR组MDA含量于阻断3h开始增加，至放松3h达到高峰，RR组为（3.10±0.70）nmol/mg，SR组为（2.48±0.58）nmol/mg，随后略有下降，但 RR组在各时间点及SR组在放松3h时间点显著高于S组（P＜0.05）。两组比较，SR组MDA含量在各时间点低于RR组，尤其在放松6h、放松24h时差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表5。

表5 各组不同时间点组织MDA含量的变化情况（n＝6±s） nmol/mg

表5 各组不同时间点组织MDA含量的变化情况（n＝6±s） nmol/mg

24h S组组别 阻断3h 放松3h 放松6h 放松1.75±0.75 1.76±0.83 1.78±0.85 1.74±0.76 RR组 2.60±0.641） 3.10±0.701） 3.02±0.761） 2.78±0.861）SR组 2.23±0.29 2.48±0.581） 2.08±0.632） 1.65±0.692）与S组比较，1）P＜0.05；与RR组比较，2）P＜0.05。

2.2.2 组织SOD的变化 与S组比较，RR组和SR组SOD含量于阻断3h开始显著下降，至放松6h达到最低值，RR组为（198.54±23.72）U/mg，SR组为（229.36±21.65）U/mg，放松24h虽有回升，但仍显著低于S组（P＜0.01）。两组比较，SR组组织SOD含量在各时间点上明显高于RR组，尤其在放松3h、6 h时差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表6。

表6 各组不同时间点组织SOD的变化情况（n＝6±s） U/mg

表6 各组不同时间点组织SOD的变化情况（n＝6±s） U/mg

组别 阻断3h 放松3h 放松6h 放松.78±28.92 RR组 231.92±22.871） 207.40±22.581） 198.54±23.721） 204.96±22.441）SR组 250.68±26.281） 238.39±23.791）2） 229.36±21.651）2） 213.86±20.891）与S组比较，1）P＜0.01；与RR组比较，2）P＜0.05。24h S组 314.54±22.90 313.62±24.78 314.32±22.65 314

2.3 缺血再灌注后血清LDH、ET－1的变化

2.3.1 血清LDH的变化 与S组比较，RR组和SR组血清LDH含量于阻断3h开始明显升高，此后呈现持续上升趋势，至放松24h达到高峰，RR组为（528.00±31.69）U/L，SR组为（428.40±19.05）U/L，显著高于S组。两组比较，SR组血清LDH含量在阻断3h、放松3h、放松24h均显著低于RR组，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表7。

表7 各组不同时间点血清LDH的变化情况（n＝6±s） U/L

表7 各组不同时间点血清LDH的变化情况（n＝6±s） U/L

24h S组 102.40±12.62 103.80±14.97 103.00±17.51 104组别 阻断3h 放松3h 放松6h 放松.60±16.02 RR组 242.60±21.521） 295.80±15.271） 326.00±19.171） 528.00±31.691）SR组 196.80±12.111）2） 251.20±13.141）2） 327.40±15.451） 428.40±19.051）与S组比较，1）P＜0.01；与RR组比较，2）P＜0.01。

2.3.2 血清ET－1的变化 与S组比较，RR组和SR组血清ET－1的含量于阻断3h开始明显升高，RR组于放松3h时达到高峰（1.42±0.25）ng/mL，SR组于放松6h达峰值（0.79±0.20）ng/mL，此后逐渐下降，但两组各时间点均显著高于S组（P＜0.01）。两组比较，SR组血清ET－1含量在各时间点上低于RR组，除放松24h外，其他时间点差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。详见表8。

表8 各组不同时间点血清ET－1的变化情况（n＝6±s） ng/mL

表8 各组不同时间点血清ET－1的变化情况（n＝6±s） ng/mL

24h S组组别 阻断3h 放松3h 放松6h 放松0.06±0.03 0.04±0.02 0.05±0.02 0.05±0.04 RR组 1.18±0.252） 1.42±0.252） 1.12±0.252） 0.25±0.142）SR组 0.64±0.192）4） 0.74±0.272）4） 0.79±0.202）3） 0.18±0.101）与S组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与RR组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

2.4 缺血再灌注后骨骼肌组织的病理改变 组织切片HE染色显示：S组肌纤维排列整齐，横纹清晰，染色均匀，肌间质无充血渗出，见图1；SR组和RR组均有病理形态改变，阻断3h与S组比较，两组骨骼肌细胞水肿、变性，肌间隙增宽，见图2、图3。放松3h与S组比较，两组骨骼肌细胞水肿明显，间质血管扩张充血，中性粒细胞浸润，炎性反应明显。RR组炎性反应程度较SR组明显加重，中性粒细胞明显增多，并可见肌细胞溶解、点状坏死。见图4、图5。

2.5 缺血再灌注后骨骼肌超微结构观察 电镜观察：S组骨骼肌细胞结构清晰，肌浆内肌原纤维排列整齐，见图6、图7。阻断3h与S组比较，两组线粒体肿胀，肌浆网水肿变粗，部分肌浆网消失，肌纤维横纹不清，个别线粒体出现溶解，肌丝水肿断裂，Z带及M线不清晰，两组超微结构改变相似，见图8、图9。放松3h RR组肌浆网消失，线粒体溶解，出现空泡，肌纤维横纹不清。SR组肌浆网部分消失，但未出现线粒体的大片溶解现象，见图10、图11。

［本文图1～图11见封三］

3 讨论

3.1 持续缓慢放松有助于维持血液循环稳定 血液循环的稳定是维持机体正常生命活动的基础［2］。本研究显示，肢体阻断3h在恢复血液循环后动脉血流量和组织血流量迅速增加，RR组在止血带放松1min时肱动脉血流量迅速升至（46.00±3.74）mL/min，远高于S组。动脉血流量的大小主要取决于血管两端的压力差和血管对血流的阻力。肢体血液循环长时间被阻断后可造成止血带平面以上与缺血肢体远端血管内的压力差，一旦放松止血带，阻断平面以上的动脉血流量迅速涌入远端缺血肢体，使远端肢体的动脉血流量急剧增加。平均动脉压是一个心动周期中动脉血压的平均值［3］。研究发现，RR组在放松止血带后，平均动脉压明显下降，直至放松10min才逐渐得以恢复，而心率表现为明显增快，显著高于S组。可能在放松止血带后，缺血肢体缺血期间无氧代谢所聚集的二氧化碳、组胺等代谢产物也会进入循环，引起微循环的广泛开放，血管床容积增大，静脉回心血量减少、心输出量降低，从而导致血压下降、心率增快。有文献报道，在应用止血带行四肢手术的99例病人中，有74例在松解止血带后发生不同程度的血压下降、脉搏增快、心悸不适等反应，其中有3例发生严重全身反应［4］。在本研究中，放松止血带后平均动脉压及动脉血流量均出现不同程度的下降。

本研究还显示，SR组动脉血流量、平均动脉压及心率的变化程度明显小于RR组，说明对减轻放松止血带后血液循环的波动起到一定作用。该研究结果与相关文献报道基本一致［2］，但与其所采用的间隔3min分两次放气的方法相比，本研究所采取的放松方法使袖带内气体的排放速度更加均匀。本研究还发现，持续缓慢放松方法可降低松解止血带后组织血流量的增加程度，进一步证实持续缓慢放松方法在再灌注早期阶段通过机械调控再灌注血流，降低止血带阻断平面以上血液流入肢体缺血区域的速度，改善再灌注时的高压力、高动力和高灌注状态，避免短时间内血液大量涌入缺血区对体循环血容量的影响，从而有助于维持血液循环稳定。

对于阻断时间的选择，已往动物实验表明，缺血时间不超过3h，肌细胞内ATP分解、pH降低、磷酸肌酸耗竭将随着缺血再灌注开始恢复，组织改变为可恢复性细胞变性，骨骼肌基本可以耐受［5，6］，如阻断长达4h～6h，肌细胞将出现不可逆的损伤［5，7］，故本实验选择阻断3h为再灌注起始时刻以便更好地研究持续缓慢放松对犬骨骼肌缺血再灌注损伤的影响。

3.2 持续缓慢放松可减轻再灌注后肢体骨骼肌细胞的损伤 缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前较为普遍接受的是“自由基损伤学说”“炎症反应学说”［8，9］。研究表明，肌肉组织缺血再灌注后数分钟内，血液和组织内的氧自由基含量可显著增加［10］。自由基的产生主要通过黄嘌呤氧化酶的激活、中性粒细胞的活性暴发、儿茶酚胺的自身氧化等途径，通过与生物膜磷脂中的多价不饱和脂肪酸作用，形成一系列脂质过氧化物，导致脂质过氧化损伤，并生成大量的MDA破坏组织蛋白，使细胞进一步遭到损害。MDA是脂质过氧化反应的主要代谢产物之一，可反映组织中自由基的含量和自由基引发的脂质过氧化反应程度，间接反映细胞受自由基氧化损伤的程度。SOD是体内主要的抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，可清除超氧阴离子（O－2）及H2O2所引起的歧化反应，保护细胞免受自由基的损伤，SOD活性可间接反映机体清除氧自由基的能力。正常骨骼肌细胞内含有丰富的LDH，当细胞发生坏死后其胞内容物进入血流，因此测定血浆中特定酶含量的变化可作为缺血后肌细胞损伤的指标。本研究选用组织MDA、SOD以及血清LDH等指标反映缺血再灌注后组织损伤水平。

本研究表明，SR组骨骼肌组织MDA及血清LDH含量明显低于RR组，组织SOD则显著增加，说明持续缓慢放松可减轻缺血再灌注后脂质过氧化反应，提高SOD的活力，这可能与控制止血带放松速度，减缓血流灌注，减少无氧代谢产物进入循环，进而减少氧自由基的产生等有关。通过光镜和电镜观察骨骼肌细胞病理形态及超微结构，放松3h，SR组细胞器损伤程度较快速放松组轻，镜下结果与 MDA、SOD和LDH的检测结果一致，进一步说明持续缓慢放松可减轻缺血再灌注后骨骼肌组织的损伤程度。

3.3 持续缓慢放松可减轻再灌注后血管内皮细胞的损伤 ET－1是由血管内皮细胞分泌的，具有广泛生物学活性的多肽类物质，是目前已知体内作用最强和作用时间最持久的缩血管物质，也是一种内源性损伤因子。完整的内皮细胞可以分泌氧化亚氮合酶、内皮素、前列环素、腺苷等化合物，维持正常的微循环。研究表明血管内皮细胞功能障碍是缺血再灌注损伤的主要原因之一，缺血再灌注损伤造成毛细血管内皮肿胀、微血栓嵌顿及血栓形成、血管痉挛、白细胞黏附、红细胞聚集和组织水肿，形成微循环无复流现象又进一步加重缺血性损害［11］。

本研究结果显示，RR组血清内皮素的含量于阻断3h开始明显升高，在放松3h时达到高峰，此后逐渐下降，但仍高于S组，提示微血管内皮功能受损。而SR组血清内皮素水平明显低于RR组，除放松24h外，其他时间点差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。说明持续缓慢放松对保护血管内皮细胞功能起到一定作用，其原因可能与持续缓慢放松促进血液循环稳定，改善微循环，有助于消除复流后产生的氧自由基，进而减轻内皮损伤有关。Loukogeorgakis等［12］发现，在肢体缺血再灌注之前给予数次短暂再灌注/缺血的后适应处理可以改善健康志愿者缺血再灌注后的内皮功能不全，并指出原因可能是激活了内源性保护机制：抑制再灌注早期的氧自由基损伤、钙超载、线粒体通透性转换孔道（MPTP）的开放以及促进氧化亚氮合酶的表达，KATP通道的开放。本研究应用的持续缓慢放松方法虽然与后适应处理方法不完全相同，但都是施加于缺血再灌注肢体的保护措施，在一定程度上提高了机体对缺血的耐受性，发挥了对内皮细胞功能的保护作用。

4 小结

相对于常规的快速放松止血带的方法，持续缓慢放松止血带可减轻缺血组织的再灌注损伤，主要原因可能是持续缓慢方法有助于维持血流循环的稳定，减轻脂质过氧化反应及血管内皮的损伤程度，所以对肢体缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

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