成人骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性

王翔毅 栗济深 刘福泉 刘来兴 陆钰 朱玉德

成人骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性

王翔毅 栗济深 刘福泉 刘来兴 陆钰 朱玉德

目的 探索体外培养脑出血后遗症患者骨髓基质细胞(BMSCs)的方法及扩增后的生物学特性。方法 取脑出血后3个月以上患者髂骨骨髓组织, 去除淋巴细胞后采用静置贴壁培养法接种培养,经多次换液纯化。在倒置相差显微镜下观察细胞形态, 取第3、6代应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD105因子的表达。结果 倒置相差显微镜下接种48 h后, 发现少数细胞贴壁, 呈梭形, 6～8 d后细胞形成集落。传代后, 细胞形态趋于一致, 可成漩涡状。流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性,而CD29、CD105阳性。结论 体外密度梯度离心法和贴壁静置可以获得大量高度均一的表型符合骨髓基质细胞的细胞。

骨髓基质细胞；细胞培养；表面抗原

细胞移植开辟了一条治疗脑损伤后遗症的途径, 目前发现BMSCs植入后会改变损伤区的局部环境, 通过自分泌和旁分泌神经营养因子来保证自身的存活和促发内源修复［1］。骨髓基质细胞是成体干细胞,与其他的干细胞相比有显著的优越性,是细胞移植治疗中枢神经系统疾病的种子细胞之一。由于骨髓中细胞成分比较混杂, BMSCs在骨髓中含量极少,仅占骨髓中有核细胞的 0.001%～0.01%, 实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增［2］。本实验对人BMSCs进行体外分离培养, 并对培养细胞的表面抗原进行测定, 为临床应用提供足量有活性的骨髓基质细胞。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque (1.077 g/ml, 上海试剂二厂), DMEM/F12培养基 (Gibco), 胰蛋白酶(Gibco), 胎牛血清(Hyclone), 异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105(Immunotech), Caliber 流式细胞仪(BD公司)、倒置相差显微镜(Nikon)、CO2恒温培养箱(Heraeus),低速离心机(北京医用离心机厂)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs获得和培养 骨髓来源：病例1, 54岁, 男,高血压脑出血患者, 行髂骨嵴骨髓穿刺获得, 无菌抽取, 肝素抗凝的骨髓中加入等体积的无钙镁磷酸缓冲液, Ficoll分离,取单个核细胞层, 用无钙镁磷酸缓冲液洗涤2次, DMEM/F12培养基洗涤1次, 以1×106/ml的细胞密度接种, 用含10% FBS DMEM/F12培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养, 第1次72 h后更换新鲜培养基, 去除未贴壁细胞并继续培养, 后每3～4天换液1次, 以去除未贴壁细胞。连续培养2周后, 当基质细胞贴壁约80%时, 按照1：2比例传代。通过传代, 对BMSCs进行纯化和扩增, 取第3、6代的细胞用于流式检测。体外培养的BMSCs采用倒置相差显微镜, 逐日观察细胞生长情况和形态特征。

1.2.2 BMSCs表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术, 测定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。

2 结果

2.1 体外培养 BMSCs形态学观察 倒置相差显微镜下, 刚接种的骨髓悬液中含有大量悬浮细胞, 无细胞贴壁；48 h后,发现少数细胞贴壁, 呈梭形。72 h后换液, 将未贴壁细胞弃去。贴壁细胞呈克隆性生长, 细胞增殖后形态多样, 呈异质性,以长梭形细胞为主, 亦可见三角形、多角形及扁圆形细胞。6～8 d后细胞形成集落。传代后, 细胞形态趋于一致, 呈长梭形, 细胞排列紧密, 可成漩涡状。见图1。细胞传至第12代时, 胞浆内颗粒物增多, 细胞折光性变差, 提示细胞活力变弱, 增殖能力减弱。

图1 体外培养的骨髓基质细胞

2.2 BMSCs细胞表面抗原检测结果 流式细胞仪分析BMSCs表面抗原, 流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性为非造血细胞, 且表达率在3代时(2.52%、2.07%)%较6代时(0.32%、0.14%)高, 说明第6代几乎为纯基质细胞。而CD29、CD105阳性说明BMSCs较为幼稚, 且3代和6代数值无差异。

3 讨论

研究已明确BMSCs是成体干细胞的一种, 但细胞成分不单一, 有可能包含不同分化阶段的前体细胞的混合物［2,3］。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潜能, 在体外经诱导可以分化为骨、软骨、脂肪组织、神经组织及肝组织等。由于骨髓来源丰富, 取材方便, 创伤小, 在组织再生和损伤修复中有很好的临床应用前景［1］。

BMSCs广泛存在于胎儿和成人的各种组织和脏器中, 骨髓组织中含量最为丰富, 为了获取种子细胞, 目前用于分离骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度离心法；流式细胞仪分选法；贴壁培养法；免疫磁珠分选法。作者用密度梯度分离联合贴壁培养法进行了BMSCs的分离和培养, 其操作简单, 经多次传代可获得足够量的细胞。流式细胞仪检测显示CD34、CD45均阴性, 传3代时表达率分别为2.52%和2.07%,较6代时0.32%和0.14%高, 说明第6代几乎为纯基质细胞。

研究表明BMSCs的表面标志尚无特异性表面标志表达,部分与间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志有关［4-6］。主要包括：①粘附分子, 如CD44等。②生长因子和细胞因子受体, 如IL受体3、4、6、7, 干扰素γ受体等。③整合素家族成员, 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。实验选用的标记物也符合鉴定BMSCs通用标志物, 因此, 本实验培养细胞符合BMSCs的免疫表型。

BMSCs具有多向分化潜能, 在细胞移植和基因治疗方面有重要优势。本实验成功对BMSCs 进行分离、纯化及培养,为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供了实验基础。

［1］ Vaquero J, Zurita M.Functional recovery after severe CNS trauma: current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells.Prog Neurobiol, 2011, 93(3):341-349.

［2］ 闫冬梅,徐开林,杜冰,等.人骨髓基质细胞的培养及鉴定.临床血液学杂志, 2009, 22(3):144-146.

［3］ 胡学昱,罗卓荆,田爽,等.成人骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞实验研究.中华神经外科疾病研究杂志, 2006, 5(2): 139-142.

［4］ 谢谦, 罗莉.成人正常骨髓基质细胞体外培养及生物学特性.口腔医学研究, 2004, 20(2):153-155.

［5］ 戚晓渊,孙泽林,刘方军.单克隆永生化人骨髓基质干细胞分化能力和VEGF分泌量的相关性.中华医学杂志, 2011,91(17): 1193-1196.

［6］ Jung S, Panchalingam KM, Wuerth RD, et al.Large-scale production of human mesenchymal stem cells for clinical applications.Biotechnol Appl Biochem, 2012, 59(2):106-120.

In vitro culture of adult marrow stroma cell and its biological characteristics

WANG Xiang-yi, LI Jishen, LIU Fu-quan, et al.Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Baotou 014010, China

Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells (BMSCs) of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics.Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae, and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte, and multiple liquid purification.Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope.Cell surface markers CD29, CD34, CD45, and CD105in the third and sixth generation were tested by flow cytometer.Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate, there were several spindle-shaped cells.After 6～8 d, cells were in colony.After passage, cellular morphology tended to be conform and swirling.Flow cytometer showed that CD34and CD45were positive, while CD29and CD105were negative.Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.

Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.005

2014-08-27］

内蒙古自然基金资助(项目编号：2010MS1135)

014010 内蒙古医学院第三附属医院神经外科

朱玉德