干酪乳杆菌产细菌素培养基的优化

魏晋梅,周玉春,张 丽,王 莉,包高良,罗玉柱,*,李保青

(1.甘肃农业大学研究测试中心,甘肃兰州 730070;2.甘肃省草食动物生物技术重点实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

干酪乳杆菌产细菌素培养基的优化

魏晋梅1,2,周玉春3,张 丽3,王 莉3,包高良3,罗玉柱1,2,*,李保青3

(1.甘肃农业大学研究测试中心,甘肃兰州 730070;2.甘肃省草食动物生物技术重点实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

为了提高乳酸菌素的产量,本研究利用响应面法优化了干酪乳杆菌产细菌素的培养基。根据单因素实验,筛选出对细菌素抑菌性能影响较大的培养基组分,利用中心复合实验设计(Central Composite Design,CCD)原理,采用响应面分析法,建立了二次多项式回归方程的预测模型,确定了最有利于干酪乳杆菌产细菌素的培养基:乳糖1.86%,胰蛋白胨1%,柠檬酸三铵3.02%。此条件下抑菌圈理论预测直径可达18.20mm,验证实验结果达到17.85mm,与预测结果一致,较优化前抑菌性能显著提高。

响应面,细菌素,培养基,优化

乳酸菌素(nisin)是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有活性的肽或前体肽[1],是目前公认的一种安全、广谱、高效的天然防腐剂[2],具有专一性,完全不产生抗药性及毒性,可有效抑制食品中腐败菌和病原菌的生长,其特殊功能近年来引起了科技产业界的极大关注。干酪乳杆菌产生的细菌素对人体有营养保健作用,具有抑菌范围广,抑菌效果好,安全可靠等优点[3]。

除乳酸菌本身的遗传特性决定细菌素的产量外,培养基成分对细菌素的产量也有很大的影响。Mn2+对nisin的产生有促进作用,Mg2+可增加片球菌素pediocin AcH的产量[4];Tween 80对乳酸链球菌SM526产nisin有一定的刺激作用[5]。本研究对干酪乳杆菌产细菌素的培养基条件进行优化,在不同碳源、氮源、无机盐条件下培养干酪乳杆菌,使其进行发酵,通过测量抑菌圈的直径大小评价得到的细菌素的活性,运用响应面优化最佳发酵条件[6],筛选出一种最优化的发酵培养基,从而对干酪乳杆菌产细菌素的工业化生产进行初探,以提高细菌素产量,并为同类抑菌物质的工业化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干酪乳杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 甘肃农业大学畜产品实验室提供。

培养基:脱脂乳培养基[7],MRS肉汤培养基[8](乳酸菌选择培养基),MRS固体培养基[9],牛肉膏蛋白胨琼脂培养基[9],营养肉汤培养基[9]。

葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等 购自上海信裕生物科技有限公司;酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨等 购自北京奥博星生物技术有限责任公司;Tween 80 购自上海西唐生物科技有限公司;K2HPO4·7H2O、CH3COONa·3H2O、柠檬酸三铵、七水硫酸镁、四水硫酸锰等 购自上海研生生化试剂有限公司,以上试剂均为分析纯。

VD-650-U洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;THZ-82N台式恒温振荡器 上海跃进医疗器械有限公司;DHP-9052电热恒温培养箱 上海申贤恒温设备厂;TGL-16M高速台式冷冻离心机 上海赵迪生物科技有限公司;牛津杯 外径8mm;培养皿 90mm。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 碳源筛选 将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,培养基组分氮源固定为2%酵母膏;碳源分别选择葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖,糖浓度取1%、2%、3%、4%、5%。接种后在37℃培养24h。将干酪乳杆菌的发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

1.2.1.2 氮源的筛选 将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,培养基组分碳源固定为2%葡萄糖;氮源分别选择酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨,氮源浓度分别取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%。接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

1.2.1.3 无机盐浓度筛选 柠檬酸三铵:将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,在培养基中分别添加1%、2%、3%、4%、5%、6%的柠檬酸三铵,接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

醋酸钠:将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,在培养基中分别添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的醋酸钠,接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

硫酸镁:将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,在培养基中分别添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的硫酸镁,接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

磷酸氢二钾:将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,在培养基中分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸镁,接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

1.2.1.4 生长因子浓度筛选 将干酪乳杆菌以5%接种量接种于MRS液体培养基中,在培养基中分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的吐温80,接种后在37℃培养24h,将发酵液转移至离心管中,4℃,8000r/min离心10min,弃去沉淀,获发酵上清液,测定抑菌圈直径。

1.2.2 响应面设计 根据单因素实验结果,采用响应面设计实验[6],运用中心复合实验设计(Central Composite Design,CCD)分析对干酪乳杆菌产细菌素的发酵条件显著影响的因素,进行3因素3水平的响应面实验[10-13]。实验设计见表1,每组实验重复3次。

表1 响应面实验设计

1.2.3 乳酸菌素活性测定-琼脂扩散法 参照张刚[14]和高丹丹等[15]的方法,制备检测平板和指示菌(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)菌悬液。吸取100μL待测样品,以无菌操作加入到检测平板圆孔内,37℃培养15h,观察并测定抑菌直径(mm)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 碳源筛选 由图1可知,保持其他物质及浓度不变的条件下干酪乳杆菌对乳糖的利用最有效,乳糖作为碳源时发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制最明显。随着乳糖浓度的增大,发酵上清液对指示菌的抑制作用越明显,当乳糖浓度在2%时,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到最大值(15.20mm和14.53mm),随后开始下降。因此选择2%的乳糖作为干酪乳杆菌产细菌素培养基的碳源。

图1 碳源单因素实验Fig.1 The single factor test of carbon source

2.1.2 氮源筛选 保持其他物质及浓度不变的条件下,干酪乳杆菌可有效利用各种氮源,其中胰蛋白胨的效果较好,当胰蛋白胨作为氮源时发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制最明显。随着胰蛋白胨浓度的增大,发酵上清液对指示菌的抑制作用越明显,当胰蛋白胨浓度为1%时,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到最大值(14.93mm和20.92mm),随后开始下降,所以1%的胰蛋白胨适合作为干酪乳杆菌产细菌素培养基中的氮源(见图2)。

图2 氮源单因素实验Fig.2 The single factor test of nitrogen source

2.1.3 无机盐筛选 醋酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾的发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制没有太大的影响,抑菌圈直径变化不明显。柠檬酸三铵的发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制最明显,其浓度在1%～6%范围内变化时,抑菌圈的直径先呈现增大趋势,然后出现缩小趋势,当柠檬酸三铵浓度为3%时,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到最大值(15.95mm和15.22mm)(图3),因此柠檬酸三铵适合做干酪乳杆菌产细菌素培养基中的无机盐。

图3 无机盐单因素实验Fig.3 The single factor test of inorganic salt

2.1.4 生长因子 生长因子Tween 80对干酪乳杆菌抑菌效果的影响如图4所示。Tween 80含量从0.05%增加到0.1%时,抑菌圈的直径有所增大;当其含量从0.1%增大到0.25%时,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑菌圈直径均呈现缩小趋势,但不同浓度下Tween 80的发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径并没有显著差异(p=0.62>0.05)。可见,Tween 80作为一种表面活性剂,在培养基中的含量为0.05%～0.25%时对细菌素的产生没有关键影响,因此,实验中不再作为响应面设计的优化因子。本实验选择Tween 80的含量为0.05%。

图4 Tween 80单因素实验Fig.4 The single factor test of Tween 80

2.2 响应面实验设计分析

以单因素实验为基础,选取对细菌素抑菌圈直径影响较显著的培养基(乳糖2%,胰蛋白胨1%,柠檬酸三铵3%),设计三因素三水平19个实验点5个中心点的响应面优化实验,CCD实验设计及结果见表2。

干酪乳杆菌产细菌素培养基的响应面实验分析:实验根据CCD设计进行了19组实验,利用 Design Expert 6.0.5 软件对表2实验数据进行多元回归拟合,得到干酪乳杆菌产细菌素发酵条件的回归方程:Y=-131.68173+12.12469A+176.70709B+33.43144C-1.40338A2-70.08508B2-3.50342C2-3.37500AB-1.17500AC-10.12500BC。

从该模型的方差分析表(表3)可见,所选用的二次多项模型具有显著性(p<0.05)。失拟项在α=0.05水平上不显著(p=0.3479>0.05),其相关系数为0.8120,说明该模型能解释81.20%响应值的变化,仅有总变异的18.80%不能用此模型来解释,说明该模拟合程度良好,用该模型对干酪乳杆菌发酵条件进行优化是合适的。模型回归系数如表4所示。二次函数回归模型(Quadratic Model)不同类型系数代表了不同含义,一次项系数显著性代表了模型图像在该变量坐标轴方向上呈现出线性斜面的可能性,二次项系数显著性则代表了呈现出“抛物面”的可能性,而交互项则代表呈现出“马鞍面”的可能性,其中抛物面可能性同时也是二次模型曲面存在极值的可能性。由表4可知,3类系数中,二次项系数显著性总体高于一次项系数和交互项系数,这说明该二次回归模型呈现出抛物面的可能最高。3个因素A(乳糖)、B(胰蛋白胨)、C(柠檬酸三铵)的二次项系数p值分别为0.1498、0.0117、0.0034,则说明对于这3个变量而言,存在极值的可能性分别为85%、99%、99.7%。对该模型的F值进行比较可以得到各因素的影响主次顺序为:A>B>C,即乳糖>胰蛋白胨>柠檬酸三铵。

表2 CCD 实验设计及结果

注:空间校正参数δ取1.414。

表3 二次多项式模型方差分析表

通过上述二次多项回归方程所做的响应曲面见图5～图7。从图5可知,当胰蛋白胨取一定值,乳糖含量在1.5%～2%范围内增大时,曲线较陡,在2%左右达到最大值,随后开始下降。乳糖取一定值,柠檬酸三铵从2.5%增加到3%左右时,曲线较陡,变化明显,在3%左右达到最大值,随后开始平缓下降,说明柠檬酸三铵含量在较低浓度时对干酪乳杆菌抑菌性能的影响大于较高含量下的影响(图6)。由图7可见,柠檬酸三铵含量一定,胰蛋白胨从0.9%增大到1.1%时,曲线先呈现较陡的上升趋势,在1.0%左右达到极大值,然后呈现下降平缓的趋势,即胰蛋白胨含量较低时对干酪乳杆菌抑菌性能的影响较大。

表4 回归方程系数的显著性检验

注:“*”差异显著,“**”差异极显著。

图5 乳糖和胰蛋白胨的交互作用Fig.5 The interaction of lactose and tryptone

图6 乳糖和柠檬酸三铵的交互作用Fig.6 The interaction of lactose and ammonium citrate

图7 胰蛋白胨和柠檬酸三铵的交互作用Fig.7 The interaction of tryptone and ammonium citrate

2.3 验证实验

为了验证二次多项回归方程所得预测结果的准确性,根据其最佳培养基配方:乳糖为1.86%、胰蛋白胨为1%、柠檬酸三铵为3.02%(固定因子Tween 80为0.05%),进行了3次干酪乳杆菌抑菌实验,所得平均抑菌圈直径为17.85mm,与预测值(18.20mm)很接近,相对误差未超过5%,说明模型方程可信度较高,能够很好地预测实验结果。

3 结论

本实验通过单因素实验对碳源、氮源、无机盐、生长因子进行筛选,确定了影响干酪乳杆菌生长繁殖的主要因素;通过CCD实验设计原理,建立了二次多项式回归方程的预测模型,确定了最有利于干酪乳杆菌产细菌素的培养基:乳糖1.86%,胰蛋白胨1%,柠檬酸三铵3.02%,此条件下预测抑菌圈直径可达18.20mm。验证实验结果达到17.85mm,与预测结果非常接近,比优化前抑菌性能得到明显提高。

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Optimization on fermentation medium for bacteriocin produced by lactobacillus casei

WEI Jin-mei1,2,ZHOU Yu-chun3,ZHANG Li3,WANG Li3,BAO Gao-liang3,LUO Yu-zhu1,2,*,LI Bao-qing3

(1.Instrumental Research and Analysis Center,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology,Lanzhou 730070,China;3. College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The components of fermentation medium were optimized by response surface methodology to improve the production of bacteriocin of lactobacillus casei. Based on confirming significant factors through single factor experiment,the central composite design(CCD)principle and the response surface analysis were used to establish the quadratic polynomial regression equation prediction model to determine the suitable fermentation medium for the production of bacteriocin of lactobacillus casei. The optimized fermentation medium was composed(%)of 1.86 lactose,1.0 tryptone,3.02 ammonium citrate. Under this condition,the verifying test result of the bacteriostatic ring was 17.85mm which was consistent with the theoretical value(18.20mm)of the bacteriostatic ring. The performance of the bacteriostasis was improved significantly than that before optimization.

response surface;bacteriocins;medium;optimize

2014-06-24

魏晋梅(1973-),女,硕士,副研究员,研究方向:食品科学。

*通讯作者:罗玉柱(1962)，男，博士，教授，研究方向：动物生物技术。

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2012-18)资助。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.029