多发性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表达及其临床意义分析

王丽丽，陈 林，毕桂彬，赵 松，靳风艳，牛 丰＊

（吉林大学白求恩第一医院1.脊柱外科；2.血液肿瘤科，吉林长春130021）

多发性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表达及其临床意义分析

王丽丽1，陈 林1，毕桂彬1，赵 松1，靳风艳2，牛 丰1＊

（吉林大学白求恩第一医院1.脊柱外科；2.血液肿瘤科，吉林长春130021）

目的 观察和分析多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓液中微小RNA（miRNA）－21、miRNA－15a和miRNA－16的表达及其临床意义。方法 选取50例MM患者作为病例组，根据治疗效果将其分为初治组（19例）、难治组（18例）和缓解组（13例），选取20例非恶性血液疾病患者作为对照组。对各组患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表达水平和血清β2微球蛋白（β2－MG）水平进行检测和比较。结果 各组患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表达水平的差异均有统计学意义（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05）。其中，难治组患者骨髓液中miRNA－21表达水平显著高于其他三组，miRNA－15a、miRNA－16表达水平显著低于其他三组，初治组患者骨髓液中miRNA－21表达水平显著高于缓解组或对照组，miRNA－15a、miRNA－16表达水平显著低于缓解组或对照组，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）；直线相关分析显示，MM患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－21表达水平呈正相关关系（r＝0.599，P＜0.05），与miRNA－15a表达水平（r＝－0.829）、miRNA－16表达水平（r＝－0.698）呈负相关关系（P＜0.05），多元线性回归分析结果显示，MM患者的血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－15a表达水平呈负相关关系（标化相关系数＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）。结论 MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表达水平与患者对化疗的反应性和肿瘤负荷具有相关性，可用于评价患者病情的进展、预测治疗效果和患者的预后。

多发性骨髓瘤；微小RNA；骨髓液；实时PCR；β2微球蛋白

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1461）

微小RNA（miRNA）是一类非编码的小分子RNA，可通过抑制特异靶基因的翻译或直接降解靶基因对基因进行转录后调控。有研究结果显示，miRNA的异常表达可能参与了多发性骨髓瘤（MM）细胞的增殖、分化、凋亡及耐药等过程，而且某些miRNA可作为MM的有效治疗靶点［1］，本研究针对MM患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表达及其临床意义进行了观察和分析，现将研究的具体情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2014年1月我院收治的MM患者50例作为病例组，均符合MM诊断标准，所有患者均采集骨髓液标本，患者的年龄为42－66岁，平均年龄为（53.8±4.9）岁，男性31例，女性19例。选取20例同期在门诊接受骨髓液检查且最终排除恶性血液病患者作为对照组，年龄为41－63岁，平均年龄为（52.5±4.6）岁，男性12例，女性8例。两组患者的年龄、性别构成等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 观察指标和检测方法

根据欧洲血液和骨髓移植组（EMBT）对病例组中的非初治患者的疗效评价，主要分为完全缓解（CR）、接近完全缓解（nCR）、部分缓解（PR）、微小缓解（MR）、无变化（NC）、病情进展（PD）等几个等级，并根据是否为初治及治疗后的疗效，将病例组患者分为初治组（19例）、难治组（18例）、缓解组（13例）。其中，难治组的纳入标准为疗效未达到PR等级，缓解组的纳入标准为疗效达到PR及以上。应用实时荧光定量PCR（RT－PCR）法对三组患者及对照组骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16的表达水平进行检测和比较，miRNA引物设计主要通过查询Sanger microRNA序列数据库获得，对于难以用常规方法设计引物应用颈环结构的反转录引物将micoRNA反转录成cDNA进行检测。引物设计如下：miRNA－21：forward primer 5′－GTGCAGGGTCCGAGGT－3′；miRNA－15a：forward primer 5′－CGCCTAGCAGCACATAATGG－ 3′；miRNA－16：forward primer 5′－GCCGTAGCAGCACGTAAATA－3′。

根据扩增曲线和溶解曲线判断反应质量，以2－△△Ct代表目的miRNA的表达水平，其中Ct值为扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数；采集病例组患者的清晨空腹外周静脉血标本，常规离心分离血清后，应用放射免疫法对血清标本中的β2微球蛋白（β2－MG）水平进行检测和比较。

1.3 统计学分析

本研究所有数据均应用SPSS13.0建立数据库并进行统计学分析，计量资料应用（均数±标准差）的形式表示，多组之间比较应用单因素方差分析进行处理，两两比较应用LSD法进行处理，血清β2－MG水平与骨髓液中三种miRNA表达水平的相关性分析应用Pearson直线相关和多元线性回归进行处理，以上统计学检验均以α＝0.05为检验水准。

2 结果

2.1 各组患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表达水平的比较

各组患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表达水平的差异均有统计学意义（F＝37.839、419.707、445.998，P＜0.05），其中，难治组患者骨髓液中miRNA－21表达水平显著高于其它三组，miRNA－15a、miRNA－16表达水平显著低于其它三组，初治组患者骨髓液中miRNA－21表达水平显著高于缓解组或对照组，miRNA－15a、miRNA－16表达水平显著低于缓解组或对照组，以上差异均有统计学意义（P＜0.05），而缓解组与对照组患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 多发性骨髓瘤患者血清β2－MG水平与骨髓液中三种miRNA表达水平的相关性分析

Pearson直线相关分析显示，MM患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－21表达水平呈正相关关系（r＝0.599，P＜0.05），与miRNA－15a表达水平（r＝－0.829）、miRNA－16表达水平（r＝－0.698）呈负相关关系（P＜0.05），三种miRNA表达水平与β2－MG水平相关性的散点图见图1、图2、图3；以血清β2－MG水平为因变量，以骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16的表达水平为自变量，进行多元线性回归分析，结果显示，血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－15a表达水平呈负相关关系（标化相关系数＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），见表2。

表1 各组患者骨髓液中miRNA－21、miRNA－15a和miRNA－16表达水平的比较

表2 多发性骨髓瘤患者血清β2－MG水平与骨髓液中三种miRNA表达水平的相关性分析

3 讨论

microRNA是一种内源性非编码的单链小分子RNA，长度约为19－24个核苷酸，可通过与mRNA的3’非翻译区域（3’UTR）靶向结合、抑制或降解目的mRNA从而对基因的表达发挥调节作用。近年来的研究结果显示，miRNA参与了细胞的增殖、分化、生长和凋亡等生理过程和多种疾病的病理过程［2］。大量研究证实，异常表达的miRNA是恶性肿瘤发病、进展和转移的重要调控因子，miRNA可通过多种途径调节转录后因子从而发挥重要的抑癌或致癌作用［3］。目前，学术界已经发现了多种与MM相关的miRNA，其中，主要包括miRNA－15a、miRNA－16、miRNA－34a、miRNA－194－2－192簇、miRNA－18a、miRNA－18b、miRNA－335等，而这些miRNA的表达水平与患者的血清IL－17、IL－21、IL－22、IL－23、IL－27等相关细胞因子水平、ISS分期等均具有相关性［4］，miRNA基因在MM中存在较高的突变率，miRNA19a、miRNA－19b和miRNA335基因突变可能与MM的发病机制有关，而且miRNA基因发生突变的患者的预后更差，因此，针对这些miRNA表达水平进行检测有助于对MM病程进展和预后进行预测和分析［5］。

图1 多发性骨髓瘤患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－21表达水平的相关性

图2 多发性骨髓瘤患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－15a表达水平的相关性

图3 多发性骨髓瘤患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－16表达水平的相关性

本研究将miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21作为观察指标，研究结果见表1，这说明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表达水平与患者对化疗药物的反应性具有相关性，可用于辅助预测患者的病情转归和预后。miRNA－21被认定是miRNA转录的主要驱动力，参与了细胞增殖、分化、凋亡，且与肿瘤生长、侵袭、转移等密切相关，miRNA－21在多种肿瘤组织中异常表达，很多学者主张将外周血中的miRNA－21表达水平作为潜在生物标志物用于肿瘤的诊断、疗效评价以及预后预测等方面［6，7］。近年来的研究结果证实，microRNA－21与MM具有密切的相关性，MM患者的循环microRNA－21与其血kappa轻链、血lambda轻链、血清免疫球蛋白的总量均呈显著正相关，而与其血清白蛋白水平呈负相关，针对MM患者循环miRNA－21的检测可以用于反映骨髓瘤细胞的负荷，监测MM的病情进展［8］，而且一些研究者利用成熟miRNA－21的种子序列可通过与其靶mRNA的3’－UTR区完全互补结合发挥负性调节作用这一原理，将miRNA－21作为MM基因治疗的靶点［9］。miRNA－15a、miRNA－16是被学术界认为与MM关系密切的miRNA，体外试验研究结果显示，MM细胞株可表现为miRNA－15a、miRNA－16表达水平的显著异常，而经TNF－α预处理的骨髓细胞株H929则可与MM细胞相互作用，通过调节miRNA－15a、miRNA－16表达水平来抑制MM细胞的生长和繁殖［10］，美法仑、硼替佐米等化疗药物均可上调骨髓瘤细胞的miRNA－15a、miRNA－16的表达水平，而IL－6等细胞因子则可抑制骨髓瘤细胞miRNA－15a、miRNA－16的表达［11］。

本研究中的直线相关分析显示，MM患者血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－21表达水平呈正相关关系（r＝0.599，P＜0.05），与miRNA－15a表达水平（r＝－0.829）、miRNA－16表达水平（r＝－0.698）呈负相关关系（P＜0.05），多元线性回归分析结果显示，MM患者的血清β2－MG水平与骨髓液中miRNA－15a表达水平呈负相关关系（标化相关系数＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05），说明MM患者骨髓液中的miRNA－21、miRNA－15a、miRNA－16表达水平与患者的血清肿瘤负荷标志物水平具有一定的相关性，可用于评价MM对机体的危害程度，特别是骨髓液中miRNA－15a表达水平的下降是与MM肿瘤负荷的上升相关的独立危险因素。本研究选取β2－MG作为肿瘤负荷标志物，β2－MG是一种低分子蛋白，由淋巴细胞合成并分泌，主要存在于除红细胞和胎盘滋养层细胞以外的所有有核细胞中，MM导致的恶性浆细胞过度增殖和积累会导致β2－MG合成和分泌的增加。临床研究已证实，MM患者的β2－MG水平可出现显著升高，并且与骨髓瘤细胞的负荷相平行、与肾功能损害程度成正比，因此，β2－MG已被作为一种重要的血清学标志物用于MM早期诊断、疗效评价及预后评估［9，12］。

综上所述，MM患者骨髓液中的miRNA－15a、miRNA－16和miRNA－21表达水平与患者对化疗治疗的反应性和肿瘤负荷具有相关性，可用于评价患者病情的进展、预测治疗效果和患者的预后。

［1］肖翠容，鹿全意.多发性骨髓瘤相关微小RNA的研究进展［J］.白血病·淋巴瘤，2014，（23）7：442.

［2］李艳杰，李振宇，徐开林.miRNA是多发性骨髓瘤基因治疗潜在的靶标［J］.中国实验血液学杂志，2013，21（5）：1318.

［3］李艳杰，李德鹏，闫志凌，等.miRNA和Th17相关细胞因子在多发性骨髓瘤患者中的表达及其意义［J］.中华血液学杂志，2015，36（2）：125.

［4］张凝宇，楼 瑾，李 明，等.多发性骨髓瘤微小RNA基因序列突变的检测及其意义［J］.白血病·淋巴瘤，2011，20（4）：218.

［5］刘启飞，王秀芳，焦 峰.循环miRNA－21在肿瘤中的研究进展［J］.医学综述，2014，20（19）：3521.

［6］李先承，李秀男，宋希双.MicroRNA－21与实体肿瘤关系的研究进展［J］.大连医科大学学报，2012，34（2）：182.

［7］乔永红，张 霞，徐 光，等.多发性骨髓瘤患者循环microRNA－21的表达与意义［J］.临床检验杂志，2011，29（9）：665.

［8］骆小闯，丰茂晓，古春明，等.miRNA－21种子序列反义核酸及抗多发性骨髓瘤应用［J］.生命科学研究，2013，17（6）：502.

［9］阮细生.β2－微球蛋白和C反应蛋白检测在多发性骨髓瘤中的应用［J］.国际检验医学杂志，2013，34（24）：3416.

［10］徐欣欣，夏 雷，杨 娇，等.肿瘤坏死因子预处理的骨髓间充质干细胞对骨髓瘤细胞株H929集落形成能力及miRNA－15a／16等相关基因表达的影响［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2015，35（2）：178.

［11］藏美蓉，李 菲，安 刚，等.多发性骨髓瘤患者骨髓基质细胞调节miRNA－15a／－16表达在骨髓瘤细胞耐药中的作用及机制［J］.中华医学杂志，2012，92（16）：1100.

［12］刘传才，陈文习.血清β2微球蛋白、乳酸脱氢酶在多发性骨髓瘤诊治中的临床意义［J］.医学综述，2014，20（15）：2849.

Analysis on the expression of miRNA－21，miRNA－15a and miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myelo－ma and its clinical significance

WANG Li－li，CHEN Lin，BI Gui－bin，et al.（Department of Spine Surgery，The First Bethune Hospital of Jilin University，Changchun130021，China）

Objective To observe and analyze the expression of micro RNA（miRNA）－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid of the patients with multiple myeloma（MM）and its clinical significance.Methods 50patients with MM were selected as the case group and divided into the initial treatment group（19cases），the refractory group（18cases）and the remission group（13cases）according to the therapeutic effects.20cases of patients without malignant hematological diseases were selected as the control group.The expression level of miRNA－21，miRNA－15aand miRNA－16in marrow liquid and the serumβ2－microglobulin（β2－MG）level of the patients in all the groups were detected and compared.Results The differences of the expression levels of miRNA－21，miRNA－15a，miRNA－16in marrow liquid of the patients between all the groups were statistically significant（F＝37.839，419.707，445.998，P＜0.05）.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the patients in the refractory group was significantly higher than that in the other three groups，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than those in the other three groups.The expression level of miRNA－21in marrow liquid of the initial treatment was significantly higher than those in the remission group or the control group，the expression levels of miRNA－15aand miRNA－16were significantly lower than the remission group or the control group.The above differences were statistically significant（P＜0.05）；Linear correlation analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was positively correlated with the expression level of miRNA－21in marrow liquid（r＝0.599，P＜0.05）level，and negatively correlated with the expression level of miRNA－15a（r＝－0.829），the expression level of miRNA－16（r＝－0.698）in marrow liquid（P＜0.05）.The multiple linear regression analysis showed that the serumβ2－MG level in MM patients was negatively correlated with theexpression level of miRNA－15ain marrow liquid（standardized coefficient＝－0.976，t＝－5.838，P＜0.05）.Conclusion The expression levels of miRNA－15a，miRNA－16and miRNA－21in marrow liquid of patients with MM are correlated with the reactivity of patients to the chemotherapy treatment and the tumor burden，and can be used in evaluation of the progression of the disease and prediction of the effects of the treatment and the prognosis of the patients.

multiple myeloma；micro RNA；marrow liquid；real time PCR；β2microglobulin

R733.3

A

2015－03－22）

1007－4287（2015）09－1461－04

国家自然科学基金面上项目（81471165）

＊通讯作者