晚期糖化终产物受体中和抗体缓解腰5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的效果观察

李向南，李永华，袁红斌

神经病理性疼痛是一种常见的难治性疼痛，指原发或继发于神经系统损害、功能障碍所导致的疼痛。创伤、手术、糖尿病及感染常导致神经病理性疼痛的发生，而临床上有效的治疗办法并不多。卫星胶质细胞(sate11ite g1ia1 ce11s，SGCs)作为背根神经节(DRG)中围绕感觉神经元的胶质细胞，其神经免疫功能受到疼痛学研究的普遍重视。目前认为，外周神经损伤后，激活的卫星胶质细胞介导启动了一系列免疫炎症反应，分泌包括肿瘤坏死因子α(TNF－α)在内的一系列促炎细胞因子，介导感觉神经元的痛觉过敏［1］。晚期糖化终产物受体(recepotr for advanced g1ycation end products，RAGE)，是一种细胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受体，广泛分布，其下游NF－κB入核调节炎症因子的释放［2］。本研究旨在观察抑制炎症因子的上游RAGE中和抗体是否对腰5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的缓解有更好的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 雄性SD大鼠，体质量200～250 g，由第二军医大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(沪)2007－0003。筛选基础痛阈值在10～18 g之间的大鼠，分为3组:(1)对照组10只，暴露左侧L5脊神经，但不结扎，注射生理盐水。(2)安慰剂组10只，暴露左侧L5脊神经并结扎，术后鞘内注射生理盐水。(3)药物组10只，暴露左侧L5脊神经并结扎，手术后鞘内注射RAGE中和抗体5 μg/d，至术后第7天。各实验组大鼠采用低剂量(约 10 μ1)缓慢注射(3.3 μ1/min)的方法以保证注射药物扩散在大鼠腰5脊神经。实验中SD大鼠在标准条件下饲养，自由摄取水和食物，手术前6 h禁食禁饮。

1.2 方法

1.2.1 鞘内置管 于大鼠腹腔注射戊巴比妥钠20 mg/kg，消毒后，沿脊椎中线切开皮肤，找到 L5、L6棘突根部缝隙，用小针刺破，将PE－10导管内充满生理盐水后，从缝隙中插入髓鞘内约1.5 cm。导管从皮下沿脊柱向上在大鼠颈部穿出固定，封闭导管，消毒分层缝合肌肉及皮肤。以大鼠鞘内注射10 μ1利多卡因后后脚明显出现瘫软，30 min内恢复反应作为手术成功的标准。置管成功后单笼饲养。

1.2.2 动物模型建立 将置管成功的大鼠，参考Kim等［7］方法建立大鼠腰 5神经根结扎(SNL)模型。大鼠麻醉后，于大鼠L4～S2棘突水平沿背部皮肤作纵向中线切口，分离肌肉至第5腰椎横突，切断横突暴露第5腰神经，用5－0丝线结扎神经，缝合皮肤与肌肉，避免术后感染。对照组仅暴露但不结扎L5神经，其余步骤相同。

1.2.3 免疫组化荧光染色 采用数字表法随机选取正常大鼠和SNL后大鼠各4只麻醉后灌流固定，取术侧L5和L4背根神经节，放入4%PFA固定4～6 h，然后用20%蔗糖/PBS溶液脱水2 d。将组织包埋15 μm切片，贴片在92.5℃的水浴抗原修复10 min。0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min。贴片滴加羊抗RAGE多克隆一抗(1∶100)，室温孵育16～18 h，0.01 mo1/L PBS 漂洗3 次，每次5 min，然后加Cy3－驴抗羊 IgG 二抗(1∶400)，0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min，加甘油分封片。在荧光显微镜下观察并拍照(×400)。

1.2.4 测定机械缩爪阈值和热刺激缩爪潜伏期分别于手术前1 d、手术后第1、3、5、7天测定大鼠机械缩爪阈值(paw withdraw1 thresho1d，PWT)和热刺激缩爪潜伏期(paw therma1 withdraw 1atency，PT－WL)。测定前将大鼠置于有机玻璃箱内适应15 min后，用von Frey纤毛丝自金属网下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持续时间≤4 s，大鼠出现缩足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定首先从2 g刺激开始，如该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激;如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激。如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次。最大力度为15 g，大于此值时记为15 g。每次刺激间隔30 s。用热板法测定各组大鼠热刺激缩爪潜伏期。将大鼠放入热板痛觉测痛仪上。待大鼠在透明的玻璃箱内安静后，开启电源辐射刺激足底。当大鼠出现逃避性抬腿或者舔足时，立刻切断热源，记录开始照射至出现缩足逃避反射时间(s)，照射截止时间为20 s，以防大鼠足底灼伤。每只大鼠重复3次，取平均值即为PTWL。

1.2.5 ELISA测定 将大鼠麻醉后，在生理盐水冰面上迅速分取L5背根神经节，匀浆粉碎组织后加入组织裂解液，0℃静置30 min，以12 000 r/min低温离心5 min后，采用BCA法测定蛋白含量。采用双抗体夹心ABC－ELISA法检测TNF－α和白细胞介素(IL)－1β。将酶标包被板分别设置标准孔、待测孔和空白对照孔，将标准液和样本分别加入相应孔中37℃孵育1 h，洗涤;加入新鲜稀释的酶标第二抗体37℃孵育40 min，洗涤，加入底物 OPD，显色，在492 nm处测光密度值，通过绘制标准曲线求出标本的 TNF－α、IL－1β 水平。

1.3 统计学处理 数据使用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one－way ANOVA)，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型建立 L5 SNL术后大鼠出现术侧后足不愿着地、足底外翻等典型机械痛敏体征，机械缩爪反射阈值呈逐步下降，说明制作的SNL模型是成功的。

2.2 SNL术后RAGE表达量变化 图1 A、B、C分别表示大鼠正常背根神经节、SNL术后L5背根神经节、SNL术后L4背根神经节。可见SNL术后RAGE平均荧光强度为(42.80±4.19)，比术前(19.78±4.19)表达水平增高(P＜0.05)，而L4背根神经节并无明显变化。结果提示，SNL术后RAGE在神经病理性痛疼的发生中可能发挥重要作用。

图1 RAGE在SNL前后表达变化免疫组化图

2.3 行为学研究结果 SNL术后，L5背根神经节RAGE平均荧光强度(42.80±4.19)比术前(19.78±4.19)增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。安慰剂组大鼠术后1、3、5、7 d机械缩爪阈值(9.30±2.10，4.60±1.35，3.80 ±1.4，3.60 ±1.26)与对照组(13.00±2.58，12.50±2.64，13.50 ±2.42，13.00±2.58)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。安慰剂组大鼠术后1、3、5、7 d热刺激缩爪潜伏期(10.01±1.16，5.40+1.50，4.32 ±1.16，4.40 ±1.43)与对照组(12.80±1.14，13.00±1.25，12.70 ±1.34，12.80±1.55)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。药物组大鼠术后3、5、7 d机械缩爪阈值(8.00±2.31，7.40±2.12，7.20 ±1.93)与安慰剂组(4.60±1.35，3.80±1.40，3.60 ±1.26)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。药物组大鼠术后3、5、7 d热刺激缩爪潜伏期(8.15±1.37，8.26±1.29，7.00±1.07)与安慰剂组(5.40±1.51，4.32±1.16，4.40±1.43)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

2.4 各组大鼠TNF－α和IL－1β的表达变化 为了确定RAGE中和抗体发挥镇痛作用的机制，笔者通过ELISA检测了其下游促炎细胞因子TNF－α和IL－1β的表达情况。药物组大鼠术后L5背根神经节TNF－α表达量(70.53±6.57)与安慰剂组(109.90±4.97)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。药物组大鼠术后L5背根神经节IL－1β表达量(88.24±3.60)与安慰剂组(168.77±6.34)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

图2 各组大鼠不同时间点机械缩爪阈值与热刺激缩爪潜伏期

3 讨论

RAGE作为细胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受体，具有多种配体，包括HMGB1 S100/钙结合蛋白、淀粉样多肽［3］。在生理状态下呈低水平表达，当细胞处于激活或应激状态时，受损细胞中RAGE的表达增多。RAGE与配体结合后激活细胞内各种信号转导机制，其中最重要的是氧化应激反应的增加和免疫炎性反应的加剧，最终产生致病效应。RAGE与不同配体结合后，可以激活细胞内不同的信号传导通路，比如 Ras－ERK、p38－MAPK 和 cdc42/rac途径，其多种信号通路大部分可通过NF－κB调节基因转录。NF－κB的激活可引起靶细胞产生大量的促炎因子，加剧炎症反应［4］。而外周神经组织损伤后，作为外周传入中枢信号换元的重要结构，背根神经节的功能异常对痛觉异常和痛觉过敏具有关键作用。卫星胶质细胞围绕感觉神经元，由缝隙连接相连，包绕感觉神经元构成了一个感觉神经元的微环境，一方面调节神经元的功能，另一方面其稳定性也受神经元的影响。笔者的研究发现RAGE在L5脊神经结扎后的DRG组织中表达增加，印证了Shibasaki等研究结果，根据其研究报道，RAGE在SNL模型建立后脊髓背角的表达没有显著差异［5］。

图3 各组大鼠背根神经节中TNF-α和IL-1β的表达情况

外周神经损伤后，卫星胶质细胞的功能和状态发生改变。激活的卫星胶质细胞增殖并启动了一系列免疫炎症反应，介导DRG感觉神经元的痛觉过敏，在这个过程中释放大量的促炎症因子。以往的研究中发现，肿瘤坏死因子α是神经系统较早释放的促炎细胞因子之一，其受体TNFR在毗邻损伤的外周神经元上表达上调［3］，提示TNF－α可能在神经病理性疼痛的形成和发展中发挥重要的作用。炎症因子一方面作用于神经元，通过胶质神经元交互作用改变神经元的敏感性，另一方面又可自分泌作用于SGCs，形成正反馈，使pERK水平长时间增高，进一步增加其下游NF－κB表达入核促炎因子的释放，加剧疼痛状态的维持等［6］。虽然干预TNF－α的信号通路可以改善外周神经损伤导致的痛觉过敏，但临床上通过干预炎症因子的方法治疗疼痛存在治疗时间窗短，疗效差等问题［7］。笔者的研究将炎症因子的上游调节蛋白RAGE作为靶点，采用鞘内给予RAGE中和抗体而阻断RAGE信号传导能够扭转周围神经损伤后导致的痛觉过敏，可能是通过抑制卫星胶质细胞的活化减少了TNF－α和IL－1β生成。

综上所述，外周神经损伤可引起RAGE在背根神经节的表达增高，而鞘内注射RAGE中和抗体，可以减少TNF－α和IL－1β的表达并且改善SNL后大鼠痛阈值。鉴于RAGE对神经病理性疼痛发挥的作用，干预其信号通路传导对治疗神经病理性疼痛的具有良好的前景。

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