抑制Toll样受体4表达对巨噬细胞极性转化的影响

翟振丽，申 炜，马维红，焦清海

巨噬细胞的极性是指巨噬细胞根据微环境的变化改变自身表型和生理特性，从而分化为特征差异的不同种群。根据激活方式和功能的不同巨噬细胞可分化为经典激活性巨噬细胞(c1assica11y activated macrophages，CAMs或M1)和替代激活性巨噬细胞(a1ternative1y activated macrophages，AAMs或 M2)。M1型巨噬细胞主要负责抵抗病原微生物，发挥促炎作用;M2型则具有抗炎和组织修复的功能［1］。

巨噬细胞极性转换的机制尚未完全阐明，是当前研究的热点。为明确TLR4与巨噬细胞极性转换的关系，本研究通过观察TLR4阻滞剂CLI－095抑制To11样受体 4(To11－1ike receptors，TLR4)mRNA 表达后对巨噬细胞表型标志物的影响，探讨TLR4在巨噬细胞极性转换中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(4～6周，雌性)，体质量16～20 g，SFP级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK(湘)2011－0003。

1.2 主要试剂和仪器 细胞培养基高糖DMEM、胎牛血清(Hyc1one公司)，双抗(氨苄青霉素钠、硫酸链霉素)(上海第四制药厂)，胰酶(华美生物工程公司)，小鼠重组γ－干扰素(Peprotech公司)，大肠杆菌脂多糖(Sigma 公司)，TLR4 阻滞剂 CLI－095(Invivogen公司)，异硫氰酸荧光素(f1uorescein isothiocyanate，FITC)标记的大鼠抗小鼠F4/80抗体(BioLegend公司)，CD16/32抗体(BioLegend公司)，CD206抗体(ABD公司)，FITC标记的同型抗体(BioLegend公司)，小鼠白细胞介素(IL)－12、IL－10 ELISA 检测试剂盒(达科为生物技术有限公司)，RNA提取试剂盒(北京艾德莱试剂公司)，M－MLV逆转录试剂盒(Invitrogen公司)，荧光定量 PCR试剂盒 Maxima SYBR Green qPCR master MIX(Thermo公司)，TRL4及内参β-actin基因的引物由Invitrogen公司合成;FASC AriaⅢ细胞仪(美国BD公司)，酶标仪(美国伯乐)，荧光定量PCR仪(美国ABI7500)。

1.3 骨髓来源巨噬细胞的培养及分组 参考Prade1等［2］的方法，经L929成纤维细胞分泌的巨噬细胞集落刺激因子诱导生成骨髓来源的巨噬细胞。采用流式细胞仪检测小鼠巨噬细胞膜特异性标记F4/80，鉴定巨噬细胞纯度。将实验细胞按数字表法随机分为3组:(1)对照组，常规培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞48 h，不给予任何药物处理。(2)模型组，诱导生成的巨噬细胞常规培养24 h，换液后加入终浓度为1.0×105U/L的γ干扰素(IFN－γ)和5 μg/L的脂多糖(LPS)培养24 h。(3)处理组，先予1 mg/L的CLI－095培养细胞24 h，换液后加入终浓度为1.0×105U/L的 IFN－γ和5 μg/L的 LPS培养24 h。

1.4 流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达 用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，计数，5×105个/管分装，2 000 r/min(离心半径11 cm)离心10 min，弃上清，再用100 μ1 PBS重悬细胞，分装至1.5 m1 EP管中，分别加入0.5 μg FITC标记的大鼠抗小鼠F4/80抗体，1 μg FITC 染色的 CD16/32 抗体，1 μg FITC 染色的CD206抗体及对应的同型抗体，4℃避光孵育30 min，PBS 清洗 2 次，离心，再用 300 μ1 PBS 重悬后用流式细胞仪检测。

1.5 ELISA检测细胞因子分泌 收集各组巨噬细胞的培养上清液，检测分泌型IL－10、IL－12的表达水平。按照试剂盒的说明操作，配好标准品，设置阴性对照，加入标记抗体，温育、洗板、终止、读板，450 nm波长检测吸光度。

1.6 实时荧光定量PCR检测 按试剂盒说明书提取细胞总RNA，然后逆转录成cDNA，－20℃保存备用。根据基因库设计PCR引物序列如下:TLR4引物:上游 5’－AGACCTCAGCTTCAATGGTG－3’;下游5’－GAGACTGGTCAAGCCAAGAA－3’。β－actin 引物:上游 5’－TCCGTAAAGACCTCTATGCC－3’;下游 5’－TACTCCTGCTTGCTGATCC－3’。根 据 SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明操作，利用美国ABI7500荧光定量PCR仪检测。反应体系为20 μ1:SYBR Green 染料10 μ1，PCR 上游引物(10 μmo1/L)0.8 μ1，PCR 下游引物 (10 μmo1/L)0.8 μ1，ROX 0.005 μ1，待测样品 cDNA 1.6 μ1，去离子水 6.75 μ1。反应条件:50℃预处理2 min，95℃预变性10 s，95℃变性15 s，60℃退火60 s，40个循环;做扩增曲线及融解曲线;每个样本均做3个复孔，重复检测3次，反应以 β－actin为内参对照;采用比较循环阈值法(ΔΔCt)分析样本中TLR4 mRNA的相对含量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，2组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓来源巨噬细胞的鉴定 体外将原代骨髓细胞诱导分化生成骨髓来源巨噬细胞，利用流式细胞仪检测小鼠巨噬细胞的膜表面标志F4/80，纯度为(96.2±0.2)%，可用于后续试验。

2.2 M1型巨噬细胞的建立 模型组与对照组比较，CD16/32［(91.17±1.99)%比(66.2±2.17)%］和IL－12［(747.27±3.74)比(220.87±8.17)ng/L］的表达率明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05);CD206［(0.33±0.12)%比(0.77±0.12)%］明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05);IL－10［(22.91±2.47)%比(23.56±4.30)ng/L］差异无统计学意义(P＞0.05)，符合M1型巨噬细胞膜表面标志物CD16/32高表达、CD206表达微弱、分泌因子IL－12高表达、IL－10呈低表达的表型特点，提示造模成功。

2.3 CLI－095对TLR4 mRNA表达的影响 用荧光定量PCR检测TLR4 mRNA的表达，结果显示:模型组TLR4 mRNA的表达明显高于对照组(1.000±0.003比0.778±0.002)，处理组TLR4 mRNA的表达明显低于模型组(0.804±0.009比1.000±0.003)，差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示M1型巨噬细胞TLR4呈高表达，而CLI－095对TLR4的表达具有抑制作用。

2.4 膜蛋白CD16/32和CD206的表达以及分泌型IL－10和IL－12的检测 处理组巨噬细胞CD206的表达阳性率［(2.87±0.21)%比(0.33±0.12)%］和分泌型IL－10的表达［(182.67±6.12)%比(32.91±2.47)ng/L］明显高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05);CD16/32表达阳性率［(54.83±1.60)%比(91.17±1.99)%］及分泌型IL－12的表达［(184.67±9.71)%比(747.27±3.74)ng/L］明显低于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，符合M2型巨噬细胞高表达 CD206、IL－10，低表达 CD16/32、IL－12 的表型特点。见图1～3。

图1 对照组膜蛋白CD16/32和CD206表达

3 讨论

图2 模型组膜蛋白CD16/32和CD206表达

图3 处理组膜蛋白CD16/32和CD206表达

巨噬细胞是一种不均一的多亚群细胞类型，它的泛在性和分化的组织特异性赋予巨噬细胞一些特异性的功能，根据功能不同巨噬细胞分为M1型和M2型2种极化表型，分别代表巨噬细胞功能的两个极端。巨噬细胞极性概念的提出使人们对巨噬细胞这一研究对象有了新的认识，M1型巨噬细胞具有很强的促炎能力，其分子标记物通常选用IL－12和CD16/32，M2型巨噬细胞的分子标志物主要有CD206和IL－10，具有抗炎、组织修复的作用。巨噬细胞具有可塑性，M1与M2型巨噬细胞之间存在相互转化的现象［3］。环磷酸腺苷可抑制巨噬细胞的促炎因子分泌，升高抗炎因子，形成M1到M2的表型转换［4］。通过人为干预诱导巨噬细胞表型向有利的方向极化是今后研究的方向，Hasegawa－Moriyama等［5］研究显示，罗格列酮通过增加M2/M1的比例减弱疼痛敏感性。法舒地尔通过诱导M2型巨噬细胞极化抑制炎症反应治疗脑脊髓炎［6］。

近些年有关巨噬细胞与TLR4相关性研究显示，巨噬细胞在聚集的情况下，TLR4缺乏可减弱脂肪细胞的炎症反应和胰岛素抵抗［7－8］;M1型巨噬细胞对TLR4呈高表达，而M2型巨噬细胞通过高表达抑制肿瘤因子2可负调节TLR4调节通路;高表达活化转录因子3具有抑制TLR4转录、减少M1型巨噬细胞极化的作用［9］;TLR4缺乏可减弱炎症反应，促进脂肪组织中M2型巨噬细胞生成［9］。综合以上研究，笔者提出TLR4可能是M1型和M2型巨噬细胞之间相互转化的重要因素。

笔者的前期研究［10－11］已发现，载脂蛋白 A1(apoA1)具有抑制巨噬细胞的炎症反应的作用，可诱导巨噬细胞向抗炎性M2型极化，且发挥抗炎作用可能与抑制 TLR4－MyD88－IRF5信号通路有关。为进一步探讨TLR4在巨噬细胞极性转化中的作用，本研究利用TLR4阻滞剂CLI－095进行干预处理后与M1型巨噬细胞组比较，结果显示干预后TLR4 mRNA表达明显降低，提示TLR4的表达受到明显抑制，而处理后巨噬细胞的CD206和IL－10明显升高，CD16/32和IL－12明显下调，符合M2型巨噬细胞的特性，提示TLR4在巨噬细胞极性转化中可能具有重要的作用，抑制TLR4表达有促使巨噬细胞向M2型极化的可能。

本研究从细胞水平研究巨噬细胞极性转化与TLR4的相关性，初步显示TLR4在巨噬细胞极性转化中具有重要作用，抑制TLR4表达具有促进巨噬细胞向抗炎性M2型极化的可能。

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