赤母妇炎宁胶囊治疗慢性盆腔炎的实验研究

吕晓君 何开勇 潘望平 王平慧

[摘要] 目的 探讨赤母妇炎宁胶囊治疗大鼠慢性盆腔炎的效果及其抑菌、抗感染、镇痛作用。 方法 采用大鼠慢性盆腔炎模型（化学性烧伤及细菌性感染两种模型）观察赤母妇炎宁胶囊治疗慢性盆腔炎的作用；采用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌和乙型溶血性链球菌进行体外抑菌试验，观察赤母妇炎宁胶囊的体外抑菌作用；采用巴豆油诱导小鼠耳肿胀模型，观察赤母妇炎宁胶囊的抗感染作用；采用小鼠冰醋酸扭体反应，观察赤母妇炎宁胶囊的镇痛作用。 结果 赤母妇炎宁胶囊对大鼠化学性烧伤及细菌性感染两种慢性盆腔炎模型大鼠的病症有明显改善作用，与苯酚模型对照组比较，赤母妇炎宁胶囊能明显减轻造模后大鼠子宫肿胀度，改善病理组织学变化，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；对金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌和乙型溶血性链球菌均有明显的抑制作用；可显著抑制巴豆油诱导的小鼠耳肿胀，与阴性对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；可延长冰醋酸致小鼠疼痛反应潜伏期，减少疼痛扭体次数，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 赤母妇炎宁胶囊对大鼠慢性盆腔炎具有治疗作用及抑菌、抗感染、镇痛作用。

[关键词] 赤母妇炎宁胶囊；慢性盆腔炎；抑菌；抗感染；镇痛

[中图分类号] R711.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（a）-0023-07

慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是指女性内生殖器官及其周围结缔组织、盆腔腹膜发生的慢性炎症性疾病，多为急性盆腔炎治疗不彻底或患者体质较差使病程迁延所致[1-2]。目前西医治疗包括使用抗感染药物、盆腔给药灌注治疗、物理疗法及手术治疗等，但对于CPID的治疗效果均不理想。中医认为CPID属下腹痛、带下、月经不调等范畴，是由于下焦湿热瘀积或创伤瘀滞、脉络受阻、气血不畅而形成，治疗上应以清热解毒、活血化瘀为本。赤母妇炎宁胶囊根据临床应用多年的经验方制备而成，由赤芍、杏香兔耳风、土茯苓、苦参、延胡索、莪术、益母草组成，用于治疗CPID属湿热瘀阻症。根据功能主治和处方组成，本实验对赤母妇炎宁胶囊治疗CPID及其抑菌、抗感染、镇痛作用进行了研究，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar雌性大鼠88只，体重（200±20）g，生产许可证：SCXK（鄂）2008-0005，购自湖北省实验动物研究中心；昆明种小鼠120只，雌雄各半，体重（20±2）g，生产许可证：SCXK（鄂）2008-0003，由武汉生物制品研究所实验动物中心提供。

1.2 药物和试剂

赤母妇炎宁胶囊，由武汉药谷科技开发有限公司提供，批号：20100401，规格0.4 g/粒，每1克胶囊内容物相当于生药8.1 g，人体推荐日用量0.648 g生药/kg。阳性对照药：金刚藤糖浆（150 mL/瓶，湖北福人药业有限公司，批号：20100912）、布洛芬缓释片（0.3 g/片，惠州大亚制药股份有限公司，批号：101202056）、苯酚（广东汕头市西陇化工厂，批号：20050812，临用前用1%羧甲基纤维素钠配制成25%苯酚胶浆）、巴豆油（临用前配制成2%溶液，巴豆油∶乙醇∶乙醚=0.2 mL∶2 mL∶7.8 mL）、冰醋酸（天津百世化工有限公司，批号：200802026）、戊巴比妥钠（中国医药上海化学试剂公司，批号：F2002091），此外，血液增菌培养基、琼脂粉、沙保罗氏琼脂、SS琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司，配制后高压蒸汽灭菌。

1.3 菌种

用于CPID模型制备的菌种为临床分离大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，由湖北省妇幼保健院检验科提供，湖北省食品药品监督检验研究院微生物实验室培养传代并计数，临用前按大肠埃希菌∶金黄色葡萄球菌∶溶血性链球菌=2∶1∶1比例，用无菌生理盐水配制成总菌含量为1×107/mL的混合菌液备用。

用于体外抑菌试验的菌种为5个菌种，标准菌株购自中国药品生物制品检定所，野生菌株由武汉市同济医院分离培养和鉴定获得，分别为金黄色葡萄球菌（标准株ATCC25923、野生株10株），大肠埃希菌（标准株ATCC25922和ATCC35218、野生株10株），铜绿假单胞菌（标准株ATCC27853、野生株10株），白假丝酵母菌（标准株ATCC90028、野生株10株），乙型溶血性链球菌（野生株10株）。

1.4 仪器

ML303型电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DS-671电子秤，上海寺冈电子有限公司；JM5102电子秤，余姚市纪铭称重校验设备有限公司；ESCO生物安全柜，新加坡艺思商科技有限公司；DNP-9162电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器YSQ-LS-5031，上海博迅实业有限公司；DME型显微镜，德国徕卡公司。

1.5 化学性烧伤致慢性盆腔炎大鼠模型的建立

取上述大鼠48只，随机分为6组，每组8只，苯酚造模。设假手术组、模型对照组、阳性对照组、赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组（1.6、0.8、0.4 g/kg，相当于生药12.96、6.48、3.24 g/kg，人拟临床用量的20、10、5倍）。造模方法[3]：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40 mg/kg），腹部75%喷雾消毒，大鼠趾骨联合上方1.0 cm处腹正中纵向切开2 cm小口，暴露子宫，针头在右侧子宫分叉处朝卵巢方向小心进针2 cm，缓慢注射苯酚胶浆0.1 mL，注毕，分层缝合，消毒手术区，左侧子宫不作处理作自身对照。假手术组仅进行开腹和关腹手术，未注射苯酚胶浆造模。造模后第7天开始灌胃给药，每日1次，连续14 d。假手术组、模型对照组给予蒸馏水（10 mL/kg）；阳性对照组给予金刚藤糖浆（10 mL/kg，相当于人用量的10倍）；赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组分别给予相应浓度药物（10 mL/kg，临用前用蒸馏水配制成0.16、0.08、0.04 g/mL）。末次给药24 h后，动物麻醉处死，摘取双侧子宫及卵巢，分别称取两侧子宫（连带相应的卵巢）的重量，计算肿胀度，以肿胀度作为炎症的指标。肿胀度=（右侧子宫及卵巢重量-左侧子宫及卵巢重量）/左侧子宫及卵巢重量×100%。右侧子宫福尔马林固定，常规切片，HE染色，光镜下对子宫进行病理组织学检查，设5个观察指标[4]，并按病变表现的严重程度分为正常、轻度、中度及重度四级，采用-、+、++、+++表示，评判标准及计分见表1。

1.6 细菌性感染致慢性盆腔炎大鼠模型的建立

另取大鼠40只，随机分为5组，每组8只，混合菌液造模。分组（其中假手术组8只与化学性烧伤CPID模型大鼠共用）、给药方法、观察指标同1.5。造模方法：暴露子宫后，用针头在右侧子宫内膜不同方向划4条损伤线造成子宫内膜损伤，然后在右侧子宫缓慢注射混合菌液0.1 mL，其他步骤同1.5。

1.7 体外抑菌试验

采用肉汤二倍稀释法[5]，测定最低抑菌浓度（MIC）。赤母妇炎宁胶囊配制成750 mg生药/mL的混悬液，以无菌肉汤进行倍比稀释（1 mL药物混悬液+1 mL无菌肉汤），共10个浓度：375.00、187.50、93.75、46.88、23.44、11.72、5.86、2.93、1.46、0.73 mg/mL。将稀释好的药液和菌液于试管中混匀后于35～37℃孵育培养18～24 h，观察试管内细菌的生长情况，根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的判断标准，进行结果判定：①据液体培养基颜色变化，浑浊度，沉淀等判定；②与阳性、阴性对照对比判定结果。药物阴性对照：皆为全阴性；液体培养基阴性对照：皆为全阴性；菌液阳性对照：皆为全阳性。以能抑制细菌生长的药物最高稀释度为其MIC。

1.8 抗感染试验

小鼠耳廓肿胀法[6]：取上述小鼠60 只，随机分为5组，每组12只。设阴性对照组、阳性对照组、赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组（1.6、0.8、0.4 g/kg，相当于生药12.96、6.48、3.24 g/kg，人拟临床用量的20、10、5倍）。阴性对照组给予蒸馏水（10 mL/kg）；阳性对照组给予布洛芬混悬液（10 mL/kg、100 mg/kg）；赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组分别给予相应浓度药物（10 mL/kg，临用前用蒸馏水配制成0.16、0.08、0.04 g/mL）。每日灌胃1次，连续14 d。末次给药1.5 h后，用2%巴豆油0.1 mL/只涂抹于小鼠右耳致炎，4 h后脱颈椎处死小鼠，齐根剪下两耳，用9 mm孔径打孔器分别打下左右耳片，电子天平称重，并计算肿胀率。肿胀率（%）=[（右耳重量-左耳重量）/左耳重量]×100%。

1.9 镇痛试验

小鼠醋酸扭体法[7]：另取小鼠60只，分组及给药方法同1.8。末次给药1.5 h后，腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。观察并记录每只小鼠致痛潜伏期以及致痛后15 min内的扭体次数。

1.10 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，大鼠子宫（卵巢）肿胀度、小鼠耳廓肿胀度、致痛潜伏期及扭体次数采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析；大鼠子宫病理组织学病变评分结果为等级计数资料，采用秩和检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 赤母妇炎宁胶囊对大鼠化学性烧伤致慢性盆腔炎的作用

2.1.1 对大鼠化学性烧伤致CPID造模后子宫和卵巢肿胀度的影响 苯酚造模后，模型对照组大鼠子宫和卵巢肿胀度与假手术组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），表明造模成功。与模型对照组比较，赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量和阳性对照组均能明显减轻苯酚造模后大鼠子宫和卵巢肿胀度，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），说明赤母妇炎宁胶囊对大鼠化学性烧伤致CPID造模后子宫（卵巢）肿胀有抑制作用，对子宫炎症有抑制作用。见表2。

表2 赤母妇炎宁胶囊对苯酚造模后大鼠子宫

和卵巢肿胀度的影响（x±s）

注：与假手术组比较，△△P < 0.01；与模型对照组比较，**P < 0.01

2.1.2 赤母妇炎宁胶囊对大鼠化学性烧伤致慢性盆腔炎子宫病理组织学的影响 子宫病理组织学检查中腔壁结构改变、上皮细胞增生、上皮细胞变性坏死、慢性炎症细胞浸润、内膜充血水肿5项指标假手术组与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），表明造模成功。与模型对照组比较，赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组和（阳性对照组）大鼠子宫病理组织学各项指标差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），说明赤母妇炎宁胶囊对大鼠化学性烧伤致CPID造模后子宫和卵巢炎症有治疗作用。见表3。

2.2 赤母妇炎宁胶囊对大鼠细菌性感染致慢性盆腔炎的作用

2.2.1 赤母妇炎宁胶囊对大鼠细菌性感染致CPID造模后子宫和卵巢肿胀度的影响 大鼠细菌感染造模后，模型对照组大鼠子宫和卵巢肿胀度与假手术组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），表明造模成功。与模型对照组比较，赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量和阳性对照组均能明显减轻细菌感染造模后大鼠子宫和卵巢肿胀度，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），说明赤母妇炎宁胶囊对大鼠细菌性感染致CPID造模后子宫和卵巢肿胀有抑制作用，对子宫炎症有抑制作用。见表4。

表4 赤母妇炎宁胶囊对细菌感染造模后大鼠子宫

和卵巢肿胀度的影响（x±s）

注：与假手术组比较，△△P < 0.01；与菌液模型对照组比较，*P < 0.05、**P < 0.01

2.2.2 赤母妇炎宁胶囊对大鼠细菌性感染致慢性盆腔炎子宫病理组织学的影响 子宫病理组织学检查中腔壁结构改变、上皮细胞增生、上皮细胞变性坏死、慢性炎症细胞浸润、内膜充血水肿5项指标假手术组与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），表明造模成功。与模型对照组比较，赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠子宫病理组织学各项指标差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），说明赤母妇炎宁胶囊对大鼠细菌性感染致CPID造模后子宫和卵巢炎症有治疗作用。见表5。

2.3 体外抑菌试验结果

经体外抑菌试验，赤母妇炎宁胶囊对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌和乙型溶血性链球菌均有明显的抑制作用。金黄色葡萄球菌MIC为23.44～46.88 mg/mL，MIC50为23.44 mg/mL；大肠埃希菌MIC为11.72～46.88 mg/mL，MIC50为23.44 mg/mL；铜绿假单胞菌MIC为23.44～93.75 mg/mL，MIC50为46.88 mg/mL；白假丝酵母菌MIC为5.86～23.44 mg/mL，MIC50为11.72 mg/mL；乙型链球菌MIC为11.72～23.44 mg/mL，MIC50为23.44 mg/mL。见表6。

2.4 赤母妇炎宁胶囊对巴豆油致小鼠耳廓肿胀的影响

与阴性对照组比较，赤母妇炎宁胶囊高、中、低剂量组和布洛芬缓释片组（阳性对照组）小鼠耳廓肿胀率降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。说明赤母妇炎宁胶囊可抑制巴豆油致小鼠耳廓肿胀，具有抗感染作用。见表7。

2.5 赤母妇炎宁胶囊对醋酸致小鼠疼痛的影响

小鼠醋酸扭体试验中，赤母妇炎宁胶囊高、低剂量组小鼠醋酸致痛潜伏期延长，高、中、低剂量组小鼠扭体次数减少，阳性对照组可延长小鼠醋酸致痛潜伏期、减少扭体次数，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。说明赤母妇炎宁胶囊对醋酸致小鼠疼痛有抑制作用，具有镇痛作用。见表8。

3 讨论

CPID属于临床常见病、多发病，病情较顽固，易反复发作，是一种较难治愈的疑难杂症，严重影响妇女身心健康，给患者造成较大痛苦。长期以来，对于CPID的治疗，西医药物主要是根据药敏试验选用抗生素为主，对病原体的杀灭疗效确切，但对细菌和病原体所导致的一系列病理损害的改善作用不明显[8]。

目前CPID的造模方法主要有化学性烧伤[9-10]、异物刺激[11-12]、细菌感染[13]、机械损伤加细菌感染[14-15]四种。化学性烧伤：苯酚胶浆作为黏堵剂，可造成输卵管化学性烧伤，导致输卵堵塞从而引起盆腔炎；异物刺激：将一小塑料管放置在动物子宫内，缝合子宫，造成输卵管堵塞，制作CPID模型；细菌感染：用单一菌液或者混合菌（多为需氧菌，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和链球菌）注入动物子宫或输卵管，从而造成CPID；机械损伤加细菌感染：用注射器针头（磨去针尖）在子宫分叉处朝卵巢方向进针并于宫腔内来回抽拉2次（机械损伤子宫内膜组织）后，注入单一或混合细菌悬液，制作CPID模型。本实验采用苯酚化学性烧伤、混合菌加机械损伤两种造模方法，造成大鼠CPID的病理变化模型。结果表明，造模子宫有明显的炎性肿胀病变，与周围器官有广泛粘连，子宫腔壁结构破坏，内膜充血水肿，上皮细胞增生、变性坏死并伴有慢性炎症细胞浸润等典型的病理改变。赤母妇炎宁胶囊对上述病理变化均有较好的改善作用，可减轻子宫和卵巢肿胀度，对化学性烧伤及细菌性感染致大鼠CPID均有较好的治疗效果。

现代医学认为，CPID主要诱发感染的因素是病原微生物上行感染，引起盆腔脏器组织的炎症[16-18]。患者往往伴有下腹坠胀、腰骶部酸痛或剧烈的下腹疼痛等症状，疼痛的解除或改善对增强治疗效果、提高患者的生活质量有重要意义。巴豆油作为诱导常见的神经源性肿胀炎症模型，可用来评价其严重程度[19]。小鼠扭体法是通过化学物质刺激腹腔所致一种非选择性的外周疼痛模型[20]，类似于临床表现炎性疼痛症状，且疼痛部位在下腹，与盆腔炎的疼痛部位相同[21]。本实验选用了多种常见的盆腔炎致病菌进行体外抑菌试验，结果表明，赤母妇炎宁胶囊对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌和乙型溶血性链球菌均有不同程度的抑制效果，有明显的抑菌作用；小鼠耳廓肿胀试验结果表明，赤母妇炎宁胶囊能抑制巴豆油致小鼠耳廓肿胀的炎性反应，肿胀率明显降低，有较强的抗感染作用；小鼠醋酸扭体法试验结果显示，赤母妇炎宁胶囊可延长醋酸致痛潜伏期，减少扭体次数，有很好的镇痛作用。因此，赤母妇炎宁胶囊治疗CPID可能与其抑菌、抗感染、镇痛作用有关。

综上所述，赤母妇炎宁胶囊对大鼠CPID具有治疗作用及较好的抑菌、抗感染、镇痛作用，本实验为临床治疗用药和进一步研究提供了依据。

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（收稿日期：2014-05-12 本文编辑：任 念）