腐乳白斑的化学组成及其抑制方法的研究

哈尔乐哈西·布勒斯别克,徐 健,沈生荣

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058)

腐乳白斑的化学组成及其抑制方法的研究

哈尔乐哈西·布勒斯别克,徐 健,沈生荣*

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058)

为探寻腐乳白斑的抑制手段,揭示白斑的物质基础,以腐乳白斑和不同品牌、不同品种腐乳为供试材料,测定溶解性、燃烧性、氨基酸组成,粗蛋白和钙离子含量,并通过毛霉菌株诱变、加入抗氧化剂处理研究腐乳白斑的抑制方法。结果表明:腐乳白斑易溶于甲酸溶液,粗蛋白含量为38.45%,钙含量为0.05 g/100 g,表明白斑的构成是以游离酪氨酸为主的氨基酸等结晶混合物。不同品牌、不同品种腐乳的氨基酸含量比较发现,白斑的形成与腐乳发酵工艺有关。毛霉菌株诱变后的白腐乳氨基酸含量有差异并出现白斑,说明物理诱变毛霉菌并不能彻底解决腐乳白斑问题。调节酒精度数发现,酒精度为13%的腐乳白斑形成率最低。在后期发酵向配料中加入抗氧化剂大豆异黄酮和茶多酚,在室温下后发酵半年,无白斑出现,表明抗氧化剂的添加有明显抑制腐乳白斑形成的作用。

腐乳,白斑,酪氨酸,抗氧化剂

腐乳,俗称豆腐乳,是中国传统发酵豆制品,是将大豆制成白腐乳坯经接种发酵、腌制、加料后发酵等工艺而制成,具有营养丰富,质地细腻、风味鲜美等特点[1]。有研究发现,适量食用腐乳可以防止老年性疾病和平衡机体营养[2]。

腐乳白斑是附着于成熟腐乳表面上的乳白色硬质圆粒状小点,有时呈片状,常附在腐乳表层松散的毛霉菌丝上,或悬浮于腐乳汁中,或沉积于容器底部,随着货架期的延长,腐乳产品的白斑会越来越多。腐乳出现白斑会影响产品的外观,为消费者难以接受。虽然腐乳白斑没有发现对人体有危害,但该问题一直是业内渴望解决的重要技术问题。

鲍松林[3]等经化学定性、HPLC定量鉴定、重结晶显微镜观察等实验,证实白点是73%～76%的酪氨酸和一些菌丝体。袁振远[4]等研究结果表明腐乳白斑是游离的酪氨酸而不是酪氨酸的金属盐。林影[5]的研究表明,当游离酪氨酸含量达到2 mg/g时即形成“白斑”。李理[6]在研究毛霉蛋白酶对大豆分离蛋白的降解作用时发现,酶解后的可溶性大豆多肽中酪氨酸的摩尔比比大豆分离蛋白中的酪氨酸的摩尔比明显增加了。江景泉[7]等的研究讨论了产生的原因可能跟酪氨酸释放有关的蛋白酶有关,内肽酶先作用生成了以酪氨酸为末端的肽链,接着再受酪氨酸羧基肽酶的作用生成酪氨酸。

本研究拟对腐乳白斑的化学组成进行较系统的分析,破除过去研究集中在酪氨酸单一因素的局限,较完整分析腐乳白斑在有机溶剂中的溶解性和粗蛋白、钙离子等化学组成及其物质基础;在此基础上以毛霉型腐乳为研究对象,通过毛霉菌株诱变和改变腐乳发酵工艺条件得到不同产品,对腐乳白斑特征性物质及其影响因素进行分析,探讨腐乳白斑形成与工艺条件之间的关系;向配料中加入抗氧化剂,以尝试抑制腐乳白斑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腐乳成品:白腐乳、青方腐乳、辣腐乳 浙江省浦江县万方腐乳厂提供,麻油白腐乳 超市购买,广州莲丰食品有限公司。

实验室自制腐乳:白坯(万方腐乳厂提供)→接种→腌制→加料后发酵。

菌株:雅致放射毛霉菌株(3.2778),微生物实验室4～8 ℃冰箱保藏。

磺基水杨酸、氢氧化钠,高氯酸、盐酸,硝酸,无水乙醚,甲酸,无水乙醇,福林一酚试剂,分析纯;混合酸消化液:硝酸∶高氯酸=4∶1。

大豆异黄酮提取物,纯度20%,广西桂林实力天然食品有限公司;茶多酚(>95%),无锡太阳绿宝科技有限公司。

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;L-8900全自动氨基酸分析仪日本日立公司;AA-700原子吸收分光光度计 日本岛津有限公司;L500台式离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 白斑制备:采用常规方法,用无菌镊子挑取5瓶某品牌腐乳里悬浮腐乳块表面和沉在瓶底的白点和白片,混合,用蒸馏水清洗表面残留菌丝,用滤纸吸干表面水分,自然风干,准确称取1 g,加入8%磺基水杨酸,混匀溶解,静置反应1 h,取上清液5000 r/min转速离心15 min,取上清液待测。

腐乳样品制备:取腐乳成品,滤纸吸干表面水分,均匀研磨成糊状,准确称取1 g,加入8%磺基水杨酸,混匀溶解,静置反应1 h,取上清液5000 r/min转速离心15 min,取上清液待用。

1.2.2 溶解性 取白斑少许观察其在清水、沸水、0.01 mol/L HCl、0.01 mol/L氢氧化钠溶液、无水乙醇、无水乙醚、甲酸溶液中的溶解情况。

1.2.3 燃烧性 酒精灯火焰常规法,挑取白斑样本置于酒精灯的氧化焰上燃烧,观察其燃烧情况。

1.2.4 粗蛋白含量 采用凯氏定氮法测定。

1.2.5 钙离子测定 根据GB/T5009.92-2003《食品中钙离子的测定》进行测定。

1.2.6 氨基酸含量测定 取1.2.1中制备的上清液,采用全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量[8]。

1.2.7 菌株诱变方法 斜面培养→孢子悬浮液→稀释待处理液→ Co60照射→处理液分离→平板培养→挑选菌落→初筛、复筛→平板培养→斜面培养→菌悬液→紫外线处理→处理液分离→平板培养→挑选菌落→初筛、复筛→平板培养→特性鉴定[9-12]。

1.2.8 抑制腐乳白斑方法 采用不同浓度的大豆异黄酮,茶多酚进行抗氧化处理(实验设计见表1)。在实验室条件(湿度90%,温度(21±3)℃)下后期发酵半年,观察白斑形成状况。

表1 抗氧化剂处理

1.2.9 数据处理方法 数据统计分析采用Origin 7.5和SAS 8.0进行,绘图采用Microsoft Excel 2007进行,数值表示为平均值±SD。

2 结果与分析

2.1 白斑的成分研究

2.1.1 溶解性 白斑样品在冷水,沸水,0.01 mol/L HCl,0.01 mol/L氢氧化钠,无水乙醇和无水乙醚溶液中的溶解性不明显,但易溶于甲酸溶液,溶解时只有少量菌丝残留并悬浮在溶液中。

实验表明腐乳白斑的极性弱,初步判断主要成分是水不溶性有机物;易溶于甲酸溶液和不易溶于乙醇和乙醚溶液中,与报道的酪氨酸的溶解性极其相似[13]。

2.1.2 燃烧性 白斑在酒精灯火焰上迅速完全燃烧,有焦味,变黑色,残留物少,表明主要成分是有机物。

2.1.3 粗蛋白含量 凯氏定氮法测定腐乳白斑粗蛋白含量为38.45%±0.045%;说明腐乳白斑粗蛋白含量较高。

2.1.4 钙离子测定 用原子吸收分光光度计测定,腐乳白斑钙离子含量为0.05 g/100 g,含量极少,说明钙盐不是白斑的主要成分。

2.1.5 游离氨基酸含量测定 对腐乳白斑进行全游离氨基酸检测结果表明(见表2),腐乳白斑的主要成分是酪氨酸,其次是苯丙氨酸,其余氨基酸含量较少。白斑氨基酸图谱见图1。

表2 白斑的游离氨基酸含量及组成(g/100 g干样)

图1 白斑氨基酸分析图谱Fig.1 Analysis of amino acid composition of white spot

2.2 腐乳白斑形成的影响因素

2.2.1 不同品牌、不同品种腐乳中游离氨基酸的组成 取制备好的腐乳样品,用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。结果表明:腐乳的质量和品种不同,氨基酸含量也不同,故不同品牌和不同品种的腐乳产品之间存在差异,具体见表3。辣腐乳、白腐乳和青方腐乳各氨基酸成分的层次基本吻合,各成分中谷氨酸含量最高。但麻油白腐乳与其余腐乳的氨基酸组分和含量有差距,其中亮氨酸含量最高,酪氨酸含量及少,并且未见白斑。同批次的辣腐乳、白腐乳和青方腐乳,白腐乳先产白斑,青方腐乳不产白斑。

2.2.2 腐乳白斑形成与氨基酸含量的相关性 用同样工艺制作的同一批腐乳在同样条件下测定(见图2),已经有白斑的腐乳样品氨基酸含量(氨基酸总量为4.360 g/100 g)显著高于无白斑的腐乳(氨基酸总量为2.345 g/100 g)(p<0.01),其中形成白斑的主要因素酪氨酸(Tyr)的含量有白斑样品明显高于无白斑样品(p<0.01),说明白斑的产生是腐乳后发酵期氨基酸含量的增加所致。

2.2.3 诱变菌株对白斑产生的影响 经菌株诱变后,实验室自制腐乳的氨基酸组成和含量结果如图3,处理前样品的氨基酸总量为1.408 g/100 g,处理后样品的氨基酸总量为1.870 g/100 g,发现处理后样品氨基酸含量显著性提高(p<0.01),经观察发现样品成熟之后仍出现白斑。

表3 不同腐乳的游离氨基酸含量及组成(g/100 g 干样)

图2 白斑与氨基酸含量的关系Fig.2 Relations between white spot and components of amino acids content注:**表示在p<0.01水平下差异显著。

图3 毛霉菌诱变处理对腐乳氨基酸含量的影响Fig.3 Effect of Mucor mutagenesis on the amino acid content of Sufu注:*表示在p<0.05水平下差异显著,**表示在p<0.01水平下差异显著。

2.2.4 酒精度对腐乳白斑形成的影响 使用不同酒精度数的汤料制得白腐乳,进行后期发酵6个月,以白斑的特征性物质酪氨酸和氨基酸组成为指标测定氨基酸含量,氨基酸总量结果如表4,酒精度为13%的腐乳氨基酸含量最低。随着发酵时间的延长,出现白斑数量增多,酒精度为18%的腐乳和酒精度为12%的腐乳发酵三个月后先出现白斑,酒精度为13%的腐乳第六个月开始出现白斑,为最晚。氨基酸各组分含量结果如图4,发现酒精度数为13%时酪氨酸含量最低。

表4 不同酒精度腐乳氨基酸总量(g/100 g)

注:1、2、3、4分别为酒精度为12%、13%、18%、20%发酵腐乳,图4同。

图4 酒精度对腐乳白斑的影响Fig.4 Effect of alcohol content on Sufu white spot

2.3 腐乳白斑形成的抑制方法

空白对照和抗氧化剂处理样氨基酸含量测定结果如图5所示,氨基酸总量测定结果为空白样品2.157 g/100 g,大豆异黄酮处理样1.036 g/100 g,茶多酚处理样0.757 g/100 g,结果处理样氨基酸总量和各组分含量均降低,表明在腐乳配料中加入抗氧化剂,可以有效抑制氨基酸含量的增加。

图5 抗氧化剂处理腐乳的氨基酸含量Fig.5 The amino acid content on different antioxidants of Sufu

空白对照和抗氧化剂处理进行对比(见图6),随着抗氧化剂添加量的增加,汤料有浑浊和颜色加深现象,其中大豆异黄酮处理组颜色呈黄色,添加茶多酚组颜色变化明显,变为深棕色。结果空白对照样出现白斑,而处理组样均未出现腐乳白斑,表明抗氧化剂对腐乳白斑的产生起抑制作用。因此可采取向配料中添加0.05 g大豆异黄酮以防止腐乳白斑生成。

图6 不同抗氧化剂处理对白斑产生的影响Fig.6 Effect of treatment with different antioxidants on Sufu white spot

3 结论

腐乳白斑经溶解性和燃烧性分析,结果表明其为有机物,且溶解特性与酪氨酸极其相似,经进一步分析其主成分为粗蛋白和以酪氨酸为主的氨基酸的复合物,粗蛋白含量为38.45%;原子吸收测得腐乳白斑中钙含量为0.05 g/100 g,表明白斑的构成并不是钙盐。

雅致放射毛霉菌株(3.2778)经诱变处理后实验室发酵白腐乳,发现处理后样品氨基酸含量显著性提高(p<0.01),样品成熟之后仍出现白斑。

不同品牌和不同品种腐乳的氨基酸分析结果表明,发酵工艺对白斑的产生有影响,制作不同酒精度数的腐乳,后期发酵六个月,随着发酵时间的延长,出现白斑数量增多。酒精度为18%的腐乳和酒精度为12%的腐乳先出现白斑,酒精度为13%的腐乳白斑出现最晚。氨基酸各组分含量结果也表明酒精度数为13%时酪氨酸含量最低。

在后期发酵过程中,加入抗氧化剂对腐乳白斑的产生有抑制作用,向配料中添加0.05 g大豆异黄酮可以防止腐乳白斑生成。

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[13]王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学教程[M].北京:高等教育出版社,2008:17.

Survey for the compounds of white spots of Sufu and their inhibitory method

Harligash.Bolesbek,XU Jian,SHEN Sheng-rong*

(School of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

To explore the material basis of white spots on Sufu and the inhibitory method,the white spots and Sufu of different brands or varieties were used as material to find out the solubility,combustibility,composition of amino acids,and the content of crude protein and calcium ion. And inhibitory method of white spot was studied throughMucorstrain inducing and adding antioxidant and the results were:the white spots of Sufu was soluble in formic acid solution,the content of crude protein was 38.45%,and the content of calcium was 0.05 g/100 g,which showed that the composition of white spot was the consisted of free tyrosine based crystalline mixture. Comparing the content of amino acid of different brands or varieties of the Sufu found that the formation of white spot was related to the process of Sufu. The content of amino acidsinMucorstrain after inducing were differences and white spots were found,which showed that physical inducing ofMucorcannot solve the problem of white spots completely. After adjusting alcohol degrees,13% of alcohol was the least white spots in Sufu. In the later of fermentation,antioxidant soy was oflavones and tea polyphenols were added,and the fermentation under temperature lasted for half a year. The result was no white spots being found,which showed that the addition of antioxidant can inhibit Sufu from white spots obviously.

Sufu;white spot;tyrosine;antioxidants

2015-03-25

哈尔乐哈西·布勒斯别克(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail:hah1021@126.com。

*通讯作者:沈生荣(1963-)，男，博士，教授，研究方向：食品分子营养与食品分子影像学，E-mail:shrshen@zju.edu.cn。

浙江省科技厅重大科技专项(2013C02022-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.031