戊糖乳杆菌S14所产抑菌物质的生物学特性研究

苏日娜,吴青海,双 全

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

苏日娜,吴青海,双 全*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

以内蒙古东部地区酸菜中分离得到的具有产抑菌活性的戊糖乳杆菌S1-4为供试菌,以大肠杆菌(Escherichiacoli)3301为指示菌,采用双层琼脂扩散法对其所产抑菌物质的生物学特性进行研究。结果表明,戊糖乳杆菌S1-4所产的抑菌物经木瓜蛋白酶处理后,其抑菌活性明显降低,但对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。该抑菌物质经热处理后,对大肠杆菌仍保持较强的抑菌活性,在pH3.5～5.5条件下,其抑菌活性较稳定。该菌株的发酵上清液分别经部分化学试剂和紫外线照射处理后,仍保持较好的抑菌活性。

戊糖乳杆菌,抑菌物质,生物学特性

细菌素(Bacteriocin)是天然的微生物防腐剂,是某些细菌在代谢过程中通过其核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或其前体[1],对其它种类的细菌具有一定的抑制作用[2]。细菌素可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物[3],而且具有自身免疫性[4],如免疫抑制、免疫激活和免疫增强等功能。由于细菌素具有无致畸、无毒性蓄积作用、不易产生耐药性、大多数产细菌素的乳酸菌都是从天然食品中分离出来等优点,所以细菌素适合在食品中应用[5]。

戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)[6]广泛存在于传统发酵蔬菜、发酵乳制品、发酵肉制品及醉鱼中[7-10],是公认的食品安全菌。国内外学者对戊糖乳杆菌所产生的抑菌物质也进行过大量研究,最早报道戊糖乳杆菌所产抑菌物质是在1999年有关pentocin TV35b 的分离纯化[11],而我国是在2004 年第一次报道了pentocin 31-1的分离纯化[12]。现已报道过的产细菌素的戊糖乳杆菌有Lb. pentosus ST151BR[13]、Lb. pentosus S-PT84[14]、Lb. pentosus IG1[15]和Lb. pentosus204[16]等。戊糖乳杆菌所产细菌素是属于II 类细菌素,分子量较小、主要抑制革兰氏阳性菌,也能抑制革兰氏阴性菌。因可耐受高温处理,并且多数都在酸性或弱碱性条件下稳定[17],所以具有广泛的应用前景。

表1 不同处理对菌株S1-4抑菌活性的影响Table 1 Antimicrobial activity of strain S1-4 after different treatments

注:-：抑菌圈直径≤8mm,表示没有抑菌效果。本文从内蒙古东部地区传统酸菜中分离得到的具有产广谱细菌素的戊糖乳杆菌S1-4作为供试菌,对其发酵产物在酶、热以及其它各种处理时的生物学特性进行研究,为乳酸菌细菌素的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌株 戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)S1-4,分离自内蒙古东部地区传统发酵酸菜汁液;指示菌 大肠杆菌(Escherichiacoli)3301,来源于内蒙古农业大学食品科学与工程学院实验室;脱脂乳培养基 脱脂乳粉100g/L、酵母提取粉10g/L;MRS液体培养基 大豆蛋白10g/L、牛肉膏5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、Tweeen 80 1mL/L、磷酸二氢钠2g/L、无水乙酸钠5g/L、柠檬三胺2g/L、硫酸锰0.02g/L、硫酸镁0.1g/L;LB培养基 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。

SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台 苏州智净净化设备有限公司;SX-500高压灭菌锅 德国TOMY公司;HPS-250生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;OHAUS EX623电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;SK-1快速混匀器 常州国华电器有限公司;PHS-25型数显酸度计 中国雷磁分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株S1-4发酵上清液的制备 菌株S1-4经活化后按2%(V/V)接种于MRS液体培养基中,在37℃培养24h后离心(6000r/min、15min)取上清液,采用直径0.22μm微孔滤菌器过滤,取得发酵上清液,放置于4℃冰箱保藏待用。

1.2.2 抑菌活性的测定 乳酸菌发酵上清液的抑菌活性测定采用双层琼脂扩散法,先以1%的无菌琼脂水溶液在培养皿底层打底,待琼脂凝固后在上面均匀摆放牛津杯,再倒带有指示菌的固体培养基,待培养基凝固后取牛津杯,在其形成的孔内加0.2mL的发酵上清液,在37℃培养24h后测量其抑菌圈直径[19]。

1.2.3 戊糖乳杆菌S1-4 所产抑菌物质对酸及酸性末端产物作用的检测与排除实验 将菌株S1-4发酵上清液分别用2mol/L NaOH调节pH至(5.50±0.02),以乳酸和乙酸调pH至(5.50±0.02)的灭菌蒸馏水为对照,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验。

1.2.4 戊糖乳杆菌 S1-4 所产抑菌物质对过氧化氢作用的检测与排除实验 在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中溶解过氧化氢酶,配成母液,加入菌株S1-4的发酵上清液使最终浓度达到5mg/mL,37℃水浴2h,以未处理的戊糖乳杆菌发酵上清液为对照,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验。

1.2.5 戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质对蛋白酶的敏感性实验 将3种蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)分别溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中配成母液,分别加入到经酸及过氧化氢排除后的菌株S1-4发酵上清液中,用HCl、NaOH 调节pH为以上各酶的最适作用pH,使它们的终质量浓度为1mg/mL,置于37℃水浴中2h后取出,pH调回5.0,并以未处理的上清液作为对照,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验,检测各种蛋白酶对戊糖乳杆菌所产抑菌物质的抑菌活性的影响。

1.2.6 不同热处理对戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质抑菌活性的影响 将菌株S1-4发酵上清液分别在不同温度(45、60、80、100、121℃)下处理15min和30min,以未经处理的发酵液为对照,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验。

1.2.7 不同pH对戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质抑菌活性的影响 将菌株S1-4发酵上清液用1mol/L的HCl和2mol/L的NaOH溶液调整至不同的pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0),以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验,以未接种过的MRS液体培养基调到相应的pH作为对照。

1.2.8 紫外线处理对戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质抑菌活性的影响 取相同体积的发酵上清液6份,倒入无菌平皿中,铺成约 1mm薄层,在无菌条件下用40W紫外灯照射1、2、3、4、5、6h。以未照射过的发酵液作为对照,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验。

1.2.9 表面活性剂及NaCl处理对戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质抑菌活性的影响 在菌株S1-4发酵上清液中分别加入Triton X-100、EDTA、吐温 80、吐温20、SDS和NaCl,使各物质的终质量浓度达到1mg/mL,30℃温浴2h,以大肠杆菌为指示菌进行抑菌实验,并以未经化学试剂处理的发酵上清液作为对照,确定此抑菌物质的化学试剂稳定性。

2 结果与分析

2.1 菌株S1-4抑菌物质的确定

乳酸菌在生长过程中除产生细菌素外,还可代谢产生有机酸、H2O2等其他具有抑菌活性的成分,因此,需排除这些干扰因素以确定抑菌作用是由细菌素产生。为了排除酸性末端产物的干扰,调发酵上清液的pH至5.5,分别以pH5.5的乳酸和乙酸作对照进行抑菌实验(表1)。

结果表明,排酸作用后,菌株S1-4仍有一定的抑菌作用,说明发酵上清液中的抑菌性不是有机酸作用的结果,还有其他抑菌物质存在。乳酸菌在代谢过程中会产生过氧化氢,有抑菌的作用。菌株S1-4发酵上清液经H2O2酶处理后,发酵上清液的抑菌圈直径与原液抑菌圈直径不显著,说明发酵上清液中过氧化氢不是主要的抑菌物质,还有其他的抑菌物质存在。

2.2 菌株S1-4产抑菌物质对蛋白酶处理的稳定性

不同蛋白酶对菌株S1-4发酵上清液处理后的抑菌效果见图1。

图1 不同蛋白酶处理对菌株S1-4发酵产物抑菌活性的影响Fig.1 Effects of Protease on the anti-bacterial activity of strain S1-4注:同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同字母为差异不显著(p>0.05);图2～图4同。

由图1可知,菌株S1-4所产抑菌活性物质对不同蛋白酶表现出不同敏感性,经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,透明圈直径略有减小,但仍具有很明显的抑菌作用,经木瓜蛋白酶处理后抑菌活性明显减小,所以对其较敏感。可能是因为木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶类,许多蛋白质和肽类都有水解作用所致[20]。该抑菌物质为非蛋白组分或者起抑菌作用的不是单一的物质,关于其具体成分有待进一步研究。

2.3 菌株S1-4产抑菌物质对热处理的稳定性

菌株S1-4所产抑菌物质经不同温度、不同时间处理时的抑菌效果如表2 所示。

表2 热处理对菌株S1-4发酵产物抑菌活性的影响Table 2 Effect of anti-bacterial activity of strain S1-4 for heat treatment

从表2可以看出,菌株S1-4 产生的抑菌物质表现出良好的热稳定性,无细胞发酵上清液在80℃,30min 的热处理条件下活性不变,随着温度的继续升高和加热时间的延长,菌株S1-4所产抑菌物质的抑菌活性呈上升趋势,在121℃,30min的热处理条件下其抑菌圈直径可达27.95mm,这个实验结果与菌株pentocin LPEM818[21]的结果类似,贡汉生[22]等分析可能由于加热使细菌素的构象发生变化,更多的抑菌活性位点暴露出来,具体原因需进一步实验验证。

2.4 不同pH对发酵上清液抑菌活性的影响

菌株S1-4所产抑菌物质对不同pH的稳定性结果如图2所示。

图2 不同pH对菌株发酵产物抑菌活性的影响Fig.2 Effect of pH on the anti-bacterial activity of strain S1-4

由图2可知,菌株S1-4所产抑菌物质在偏酸的环境中有较强的抑菌性,抑菌活性的pH范围为3.5～5.5,其酸性越强,抑菌活性就越强;当pH≥6 时,细菌素基本没有抑菌性。这说明菌株S1-4所产抑菌物质在酸性条件下有较好的稳定性。这与牛爱地等研究乳杆菌A5[23]的结果类似。

2.5 戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质对紫外线的稳定性

戊糖乳杆菌S1-4发酵上清液经紫外线照射处理结果见图3所示。

图3 紫外线照射对菌株S1-4发酵产物抑菌活性的影响Fig.3 Effect of UV radiation on the anti-bacterial activity of strain S1-4

由图3可知,经紫外线照射处理lh至6h后其抑菌活性没有太大的变化,同对照组相比,对大肠杆菌的抑菌效果没有显著的差异,所以戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质经紫外线照射后仍保持较好的稳定性。

2.6 戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质对表面活性剂及NaCl稳定性的研究

对化学试剂稳定性实验结果如图4所示。

图4 表面活性剂及NaCL对菌株S1-4发酵产物抑菌活性的影响Fig.4 Effect of surfactant and NACL on the anti-bacterial activity of strain S1-4注:1.NaCl,2.SDS,3.EDTA,4.Triton X-100,5.吐温20,6.吐温80,7.对照。

从图4可以看出,戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质经SDS、Triton X-100、EDTA、吐温 80、吐温 20和NaCl处理后没受明显影响,抑菌活性仍然保持稳定。而加入EDTA后抑菌活性明显的增加。EDTA是典型的络合剂,对革兰氏阳性菌的抑制作用则主要是由于 EDTA 与金属离子结合,对革兰氏阴性菌的抑制作用是起到外膜渗透作用。本实验结果与相近的植物乳杆菌素C19[24]、片球菌素ST18[25]的研究报道基本一致,即SDS和Triton X-100都不会使抑菌物质的活性消失。

3 结论

3.1 戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质经蛋白酶处理结果,对木瓜蛋白酶较敏感,其抑菌圈的平均直径由26.65mm降到17.80mm,而受胃蛋白酶和胰蛋白酶影响较小,处理前后其抑菌圈直径基本没有变化。因此可推测该抑菌物质为非蛋白组分的肽类或不是单一的物质。

3.2 戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质经热处理后仍保持良好的抑菌活性,在121℃热处理条件下其抑菌活性呈上升趋势,这可能是因为加热使抑菌物质的构象发生变化,更多的抑菌活性位点暴露出来所致。

3.3 菌株S1-4在pH3.5～5.5 时具有较强的抑菌活性,所以戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质在酸性条件下有较强抑菌活性。

3.4 戊糖乳杆菌S1-4发酵上清液经紫外线照射处理1h至6h后其抑菌活性没有太大的变化,所以对紫外线照射具有较好的稳定性。

3.5 戊糖乳杆菌S1-4发酵上清液经SDS、Triton X-100、吐温80、吐温20、NaCl等处理后抑菌活性仍然保持稳定。

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Characterization of antibacterial substance producedbyLactobacilluspentosusS1-4

SU Ri-na,WU Qing-hai,SHUANG Quan*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The characteristics of antibacterial substances ofLactobacilluspentosusS1-4,isolated from the sour cabbage juice in the east aria Inner Mogolia,were tested forEscherichiacoli3301 as the indicator by the double agar diffusion method. The results showed that the antibacterial activity of strain S1-4 was not destroyed after treatment with papain,but destroyed after treatment with pepsin and trypsin. This antibacterial substances ofLactobacilluspentosusS1-4 showed good thermal stability and stable antibacterial activity under acidic conditions in pH3.5～5.5. The inhibitory activity of this strain fermentation supernatant was not affected by some chemical agents and ultraviolet irradiation treatment.

Lactobacilluspentosus;antibacterial substance;biological characteristics

2014-08-25

苏日那(1989-),女,硕士研究生,研究方向:食品生物技术。

*通讯作者:双全(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品科学。

国家自然科学基金(31460443)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.027