重组人骨保护素对牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表达的影响

钟雯怡，武岐山，高 丽，刘 琪△，陈 芳，柴松宏

(1.遵义医学院附属口腔医院儿童牙科，贵州遵义 563003；2.贵州省安顺市人民医院口腔科 561000)

重组人骨保护素对牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表达的影响

钟雯怡1，武岐山1，高 丽1，刘 琪1△，陈 芳1，柴松宏2

(1.遵义医学院附属口腔医院儿童牙科，贵州遵义 563003；2.贵州省安顺市人民医院口腔科 561000)

目的 探讨重组人骨保护素(rhOPG)对牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表达的影响，为rhOPG应用于牙周炎的治疗提供实验依据。方法 选择22只Wistar大鼠，采用随机数字表法选择2只健康大鼠作为健康组；其余20只作为实验组，建立牙周炎大鼠模型，再将其分为实验对照组(n=10)和rhOPG组(n=10)，rhOPG组大鼠于上颌第2磨牙牙周袋间隙局部注入10 mg/kg rhOPG治疗。实验对照组大鼠于相同部位注射等体积灭菌注射用水。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)检测牙槽骨RANKL、OPG蛋白的表达。结果 与健康组比较，实验组大鼠牙槽骨OPG表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)，而RANKL表达水平两组差异无统计学意义(P>0.05)。与实验对照组比较，rhOPG组大鼠牙槽骨组织OPG蛋白的表达水平明显上调，而RANKL蛋白的表达明显下调(P<0.05)。治疗后rhOPG组大鼠牙槽骨中OPG表达水平明显高于治疗前，而RANKL表达水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rhOPG能调节牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG的表达。

骨保护素；牙周炎；核因子κB受体活化因子；大鼠,Wistar

牙周病是成人牙齿丧失的主要原因，而牙槽骨的吸收破坏是牙周病发生、发展的病理基础，亦是影响该疾病预后的主要因素。因此，再生吸收的牙槽骨已成为牙周组织工程研究的前沿领域和热点课题。骨保护素(OPG)/核因子κB受体活化因子及其配体(OPG/RANKL/RANK)轴对破骨细胞的分化和活化起着重要调节作用。抑制OPG/RANKL/RANK通路可有效抑制破骨细胞的分化和激活，从而抑制牙槽骨吸收[1-3]。目前，通过阻断OPG/RANKL/RANK通路来治疗牙周炎的报道尚不多见。本课题基于OPG/RANKL/RANK轴的生物学基础，以大鼠牙周炎模型作为研究载体，通过局部注射重组人OPG(rhOPG)，检测牙槽骨组织中OPG、RANKL的表达情况，为牙槽骨的修复重建寻求新的治疗途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 主要试剂包括rhOPG-Fc、免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒、兔抗鼠RANKL多克隆抗体、兔抗鼠OPG多克隆抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司。主要仪器：BS-110S电子分析天平(美国Napco公司)、KDC-20447低速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、Nikon YS100生物显微镜[尼康仪器(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与建模 22只6周龄一级(普通级)健康雄性Wistar大鼠，平均体质量197.4 g，由第三军医大学动物实验中心提供[动物合格证号SCXK(渝)2007-0005]。采用10 g/L戊巴比妥(3 mg/kg)腹腔注射麻醉并固定。采用随机数字表法选择2只健康大鼠作为健康组；其余20只作为实验组，采用0.2 mm结扎丝于上颌第2磨牙的颈部结扎1圈，术后大鼠高糖饮食喂养8周，以建立牙周炎大鼠模型。该研究获遵义医学院动物伦理委员会批准。

1.2.2 rhOPG局部注射 实验组大鼠均建模成功，于腹腔注射10 g/L戊巴比妥麻醉，取出结扎丝，行龈下刮治术。采用随机数字表法将其分为实验对照组(n=10)和rhOPG组(n=10)，予普食喂养1周。rhOPG组大鼠于上颌患侧第2磨牙牙周袋间隙局部注入10 mg/kg rhOPG，4 d后，再行rhOPG注射，剂量同前[4]；实验对照组大鼠于相同部位注射等体积灭菌注射用水。3 d后麻醉处死取材。

1.2.3 组织标本的制作 取大鼠上颌骨组织于4%甲醛固定，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备颊舌向切片，切片厚4～5 μm。

1.2.4 SP检测 严格按SP试剂盒说明检测牙槽骨RANKL、OPG蛋白的表达，用PBS代替第一抗体作阴性对照。利用IPWIN60型全自动彩色图像分析系统对染色标本进行图像分析。每个标本采用随机数字表法随机选取2张切片，每张切片在第2磨牙近、远、中牙槽骨区域随机取4个视野(×400)分析，在每个视野内截取牙槽骨区域检测阳性信号的强度，并计算平均光密度值，计算公式如下：平均光密度=积分光密度/测量面积。

2 结 果

2.1 健康组与实验组大鼠的牙周炎表现 健康组大鼠牙槽骨无吸收表现。实验组大鼠术后8周均于术区牙龈出现不同程度的炎性反应，牙龈红肿，探诊出血，可探及较深牙周袋，上颌第2磨牙可探及根分叉，牙槽骨吸收超过根1/2，牙齿松动大于Ⅱ度，呈中、重度牙周炎的临床表现，见图1。

A：健康组;B:实验组。

图1 两组大鼠上颌第2磨牙的比较

2.2 健康组与实验组大鼠牙槽骨中OPG、RANKL蛋白的表达 健康组大鼠OPG阳性表达集中在大鼠牙槽骨骨细胞中，胞膜、胞质及核膜都被染色，呈棕黄色颗粒状。RANKL的阳性表达集中在大鼠牙槽骨骨髓基质细胞中，胞膜、胞质及核膜都被染色，呈棕黄色颗粒状。与健康组比较，实验组大鼠牙槽骨OPG表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)；RANKL表达水平较高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、3。

2.3 实验对照组与rhOPG组大鼠牙槽骨中OPG、RANKL蛋白的表达 与实验对照组比较，rhOPG组大鼠牙槽骨组织OPG蛋白的表达水平明显上调，而RANKL蛋白的表达明显下调，见图4、5，表1。

A：健康组;B:实验组。

图2 大鼠牙槽骨中OPG蛋白的表达(SP×400)

A：健康组;B:实验组。

图3 大鼠牙槽骨中RANKL蛋白的表达(SP×400)

A：实验对照组;B:rhOPG组。

图4 大鼠牙槽骨中OPG的表达(SP×400)

A：实验对照组;B:rhOPG组。

图5 大鼠牙槽骨中RANKL的表达(SP×400)

a：P<0.05，与实验对照组比较。

2.4 rhOPG组大鼠治疗前、后牙槽骨中OPG、RANKL的表达 与治疗前比较，治疗后大鼠牙槽骨中OPG表达水平明显升高，RANKL表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 rhOPG组大鼠治疗前、后牙槽骨中OPG、RANKL平均光密度的比较(±s)

a：P<0.05，与治疗前比较。

3 讨 论

最近的研究揭示牙周疾病不仅是积聚细菌的作用结果，还更强调了炎症的作用。宿主的免疫应答是一把双刃剑，可以消除炎症侵袭，但过表达也会导致组织丧失和骨丢失[5]。上世纪中叶发现炎性宿主反应导致的牙槽骨的丧失可以通过OPG/RANKL/RANK通路刺激破骨细胞生成及炎症干扰导致的骨形成解耦联和骨吸收。所以除了传统的消除细菌的治疗方式外，另一个治疗途径就是干扰OPG/RANKL/RANK轴以防止骨丢失[6-9]。

OPG/RANKL/RANK轴是重要的骨代谢调节系统，阻断RANKL/RANK通路可以有效抑制骨的吸收。因此抑制RANKL/RANK通路为骨吸收治疗研究提供新思路[10-11]。OPG是肿瘤坏死因子受体超家族成员，由成骨细胞系的基质细胞产生，RANKL 属于 TNF配体超家族成员，它可以由成骨细胞系和活化的T细胞产生，OPG作为一个诱骗受体与RANKL结合，竞争性地抑制RANK与RANKL作用，从而抑制了破骨细胞活性和骨的吸收[12]。骨再建是一个极其复杂的过程，包含了很多细胞、细胞因子及信号通路的相互调节、相互影响，尤其是OPG/RANK/RANKL信号通路对维护成骨细胞与破骨细胞的活性平衡起了至关重要的作用。

牙周基础治疗之后，大鼠的牙周情况较之前中重度牙周炎明显改善，OPG 的表达上调，与牙周炎治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)，RANKL表达降低差异有统计学意义(P<0.05)。说明炎症减轻后，炎性细胞和淋巴细胞大大减少，在牙周病中，淋巴细胞是 RNAKL 一个特别重要的来源，但要使OPG 的表达明显上调还得辅助rhOPG，随基因工程的进步体外已可以合成rhOPG，它具有与生物体内OPG相同的生物功能[13]。牙周基础治疗辅加局部注射rhOPG后，RANKL表达水平降低，OPG表达水平升高，差异均有统计学意义，说明OPG/ RANKL比值的变化对破骨细胞的分化与功能起了关键作用，OPG/RANKL的比值上升时，破骨细胞的数量和活性将下降，OPG/RANKL的比值下降时，破骨细胞的数量和活性将上升。Kadri等[14]在小鼠骨关节炎模型腹腔注射OPG,与对照组相比,骨的体积/组织比明显增加，骨小梁的分离明显减少，并认为OPG能够防止软骨的退化。但经静脉和皮下注射rhOPG会伴有OPG蛋白质的部分降解,给药不便,易产生耐药性及免疫原性等不良反应[15]。因此本实验采用牙周局部注射给予rhOPG。很多组织产生OPG，包括成骨细胞、内皮细胞、血管平滑肌等。经基础治疗后虽然炎症有所减轻，但相比牙周健康者，骨组织和结缔组织均较少，因此能够表达和分泌OPG的细胞也少，所以健康组大鼠牙槽骨中OPG表达水平仍然高于局部注射rhOPG组，且差异有统计学意义(P<0.05)。

期望恢复健康牙周组织，牙槽骨的重建是关键，而骨重建和骨量的稳定依赖于OPG和RANKL的平衡，OPG/RANKL/RANK轴对维护成骨细胞与破骨细胞的活性平衡是最重要的一条通路。本实验采用了一周2次局部注射10 mg/kg rhOPG的方式证明了各组牙槽骨中OPG、RANKL免疫组织化学染色变化的对比差异，而对后期支持组织的形成情况尚未探究。rhOPG蛋白的使用量和注射次数，单独使用还是和别的药物联合使用效果更佳等将是该领域仍需不断探索的问题。

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Effect of recombinant human osteoprotegerin on RANKL,OPG protein expression in alveolar bone tissue of rat with periodontitis*

ZhongWenyi1,WuQishan1,GaoLi1,LiuQi1△,ChenFang1,CaiSonghong2

(1.DepartmentofPediatricDentistry,AffiliatedStomatologicHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofStomatology,AnshunMunicipalPeople′sHospital,Anshun,Guizhou561000,China)

Objective To investigate the effects of recombinant human osteoprotegerin(rhOPG) on RANKL,OPG protein expression in alveolar bone tissue of rats with periodontitis to provide the experimental evidence for the application of rhOPG in periodontitis treatment.Methods Totally 22 Wistar rats were enrolled.The random number table was adopted to select two healthy rats as the healthy group.The rest 20 rats were selected as the experimental group for establishing the rat models of periodontitis,and then subdivided into the experimental control group (n=10) and rhOPG group (n=10).Rats in the rhOPG group were locally injected by rhOPG 10 mg/kg at periodontal pocket gap of maxillary second molar,while those in the experimental control group were injected by sterile water for injection at the same site and some volume.The streptavidin-perosidase(SP) method was employed to detect the expression of RANKL,OPG protein in alveolar bone tissue.Results Compared with the healthy group,the expression levels of OPG in alveolar bone tissue of rats in the experimental group were lower with statistically significant difference(P<0.05),while the difference of RANKL expression levels between the two groups showed no statistical significance(P>0.05).Compared with the experimental control group,the expression level of OPG protein in alveolar bone tissue of rats in the rhOPG group was significantly up-regulated,while that of RANKL protein was significantly down-regulated(P<0.05).The OPG expression level after treatment in the rhOPG group was markedly enhanced,while the RANKL expression level was reduced compared with before treatment,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion rhOPG may regulates the expression of RANKL and OPG in alveolar bone tissue of rats with periodontitis.

osteoprotegerin；periodontitis;receptor activator of nuclear factor-kappa B；rats,Wistar

贵州省科学技术基金黔科合J字[2008]2187号；贵州省卫生厅科学技术基金项目(gzwkj2012-1-001)。 作者简介：钟雯怡(1978-)，硕士，副教授，主要从事牙周疾病的研究。△

，E-mail:liuqi1964@hotmail.com。

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.003

R781.4

A

1671-8348(2015)14-1879-03

2015-01-10

2015-03-17)