NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌组织中表达的探讨

李宏谦，常永超，姜雅琳，陈梦露，李小珍，高 强

·基础医学·

NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌组织中表达的探讨

李宏谦，常永超，姜雅琳，陈梦露，李小珍，高 强

目的 探讨NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌组织中的表达情况。方法 收集在我院行胃癌根治术患者的胃癌及自身正常对照组织标本各15例，慢性胃炎患者胃镜下活检胃黏膜组织标本20例，采用实时定量PCR法检测NOX2和NOX3 mRNA的表达情况。结果NOX2和NOX3 mRNA在胃癌组织中的表达量显著高于自身正常对照组织和慢性胃炎组织；NOX2 mRNA在胃癌自身正常对照组织与慢性胃炎胃黏膜组织中的表达无明显差异；NOX3 mRNA在后两者中的表达量均很少。结论 NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌的发生和发展过程中可能发挥重要作用。

NADPH氧化酶；NOX2；NOX3；胃癌；慢性胃炎

胃癌在我国是一种常见的恶性肿瘤，胃癌的发生发展涉及多因素和多环节。流行病学调查和病因学显示胃癌的发病与遗传、环境、幽门螺杆菌感染等诸多因素综合作用有关。NADPH氧化酶家族由NOX1-5、DUOX1和DUOX2组成，这组氧化酶可以产生活性氧类 (Reactive oxygen species, ROS)[1-2]。ROS是一类氧衍生的分子，包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基及各种脂质过氧化反应的产物，ROS可作为信号分子调节细胞的正常行为，也能够影响细胞的有丝分裂或表型转换，还可以诱导血管源性因子如血管内皮生长因子的分泌，最终促进肿瘤新生血管形成和肿瘤细胞增殖[3]。有研究表明，NOX可能与细胞分化相关，Geiszt等[4]发现在大肠癌细胞被诱导分化过程中NOX1表达显著升高。NOX的异常表达和激活可以引起正常细胞的恶性转化或凋亡坏死[5]。此外，NOX还影响某些基因的表达，在NOX1转染的细胞中，包括调节细胞分裂或肿瘤源性相关的基因、细胞周期相关的基因、信号传递蛋白基因、与人类肿瘤相关的蛋白质生成或激活的蛋白基因等多个基因表达上调或下调[6]。本文通过研究胃癌组织中NOX2和NOX3基因的表达情况，探讨NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 2013年8月至2014年2月河南科技大学第一附属医院收治的行胃癌根治术的患者15例(男9例，女6例)，年龄40～65岁，平均53岁，以及同期有消化道症状来我院做胃镜检查的慢性胃炎患者20例(男10例，女10例)，年龄35～60岁，平均48岁。

1.2 标本收集 手术室取切除的胃癌组织标本与距病变组织5 cm以外的正常对照组织各1块，预冷的PBS清洗后立即放入液氮中速冻，然后转入-80℃冰箱保存备用，其余大体标本送病理检查。胃镜下取黏膜组织2块，部位为胃窦部距幽门口2～3 cm处，其中1块立即存放于液氮中，然后转移到-80℃冰箱保存备用，另1块送组织病理学检查。

1.3 NOX2和NOX3基因表达检测 实时荧光定量(Real time, RT) PCR检测NOX2和NOX3 mRNA表达：取200 mg组织，放到无RNase的1.5 mL离心管中，采用Trizol(美国Invitrogene公司)法提取总RNA，用核酸定量仪测定RNA纯度和浓度。取总RNA 2 μg, 按照逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书逆转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。冰上配制PCR反应液，反应体系25 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Taq II (2×) 12.5 μL, DEPC水8.5 μL, 上下游引物(表1)各1 μL。在BIO-RAD RT PCR仪中进行PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性30 s、95 ℃ 变性5 s、57 ℃(NOX2)/ 58℃(NOX3)退火30 s、72℃ 延伸30 s，共40个循环。结果以阈循环 (Ct) 值表示，每个样本3个复孔，取平均Ct值，β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

NOX2 mRNA 在胃癌组织中的表达明显增加(4.6±1.6)分别是正常对照组织的3.1倍(P=0.03)和慢性胃炎组织的2.5倍(P=0.01)，NOX2 mRNA在慢性胃炎与胃癌自身正常对照组织的表达无明显差异(P>0.05)。与NOX2 mRNA 表达情况相同，NOX3 mRNA在胃癌组织中的表达明显增加 (10.0±1.9)，是胃癌自身正常对照组织和慢性胃炎胃黏膜组织的2.7倍(P<0.05)，后两者均少量表达且两组之间无差别。见表2。

组别nNOX2NOX3胃癌组154．6±1．610．0±1．9胃癌自身正常对照组156．2±2．311．4±1．8慢性胃炎组205．9±1．111．5±2．2

注：各组mRNA的Ct值均为减去内参β-Actin Ct值所得的ΔCt值

3 讨论

本实验采用RT-PCR方法对胃癌与自身正常对照组织及慢性胃炎组织标本中NOX2和NOX3 mRNA 进行检测，结果显示NOX2和NOX3 mRNA在胃癌组织中的表达量明显高于自身正常对照以及慢性胃炎组织，提示NOX2和NOX3在胃癌的发生发展过程中可能发挥重要作用。

NOX2基因位于X染色体p21.1，编码含有570个氨基酸的NOX2蛋白。NOX2首先在中性粒细胞和吞噬细胞内被发现，这些细胞的细胞内和细胞膜均有NOX2表达，静息状态时NOX2定位在细胞内，不产生ROS，当受到病原微生物和细胞因子等外界刺激时，NOX2会易位到细胞的表面并被迅速激活。细胞内产生的ROS可以通过信号转导通路激活NOX2。人类NOX3与NOX2氨基酸序列有56%的同源性[7]，NOX3在内耳高表达，在胎儿的脾、肾、颅骨和脑也有表达。在有调节亚基p47phox等存在的情况下能够明显增加NOX3的活性。正常情况下，NOX家族氧化酶产生的ROS能维持细胞的正常生理活动，但当机体受到外界环境中的炎症介质、细胞因子和生长因子等刺激时[8]，就会引发NOX家族氧化酶过表达产生大量ROS，产生的大量ROS可与大多数细胞大分子发生反应，可使酶失活，引起DNA损伤，DNA异常甲基化等，从而诱发癌基因激活、抑癌基因失活、修饰翻译后的蛋白质及脂质过氧化反应损伤细胞膜，机体多种疾病的发生都与此密切相关[7,9]。

胃癌的发生常伴有多种基因的异常表达，本实验研究显示NOX2和NOX3基因在胃癌组织中高表达，表明NOX2和NOX3可能在胃癌发生发展中发挥作用，过量表达的NOX2产生过多的ROS导致了DNA异常修饰从而引起DNA损伤，同时导致癌基因的激活和抑癌基因的失活，在胃癌的发展阶段，过量表达的ROS通过对MAPKs、JAK-STAT、NF-КB等[10-12]信号通路的调节，促进了细胞的转化、肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的生成和细胞凋亡的抑制等。另一方面NOX2和NOX3产生的ROS可能增加细胞的迁移速率从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[13-14]。这一系列的过程最终影响了胃癌的发生发展。本实验中NOX3在慢性胃炎胃黏膜和胃癌自身正常对照组织中的表达量均很少，而在胃癌组织中的表达量大量增加，提示在胃癌的发展过程中NOX3发挥了重要作用。总之，胃癌的发生发展涉及多环节多阶段，作者通过对NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌中表达情况的探讨，使得对胃癌的发生发展有了一些更多的思考，但还有许多细胞方面的机理未完全阐明，诸如NADPH氧化酶与肿瘤转移以及预后的关系等。NADPH氧化酶在疾病发生中的作用已得到目前众多学者的关注和研究，新的NOX蛋白家族特异性靶点的阐明，可能为生物医学的发展和肿瘤的临床治疗提供新的思路。

[1] Nauseef WM.Biological roles for the NOX family NADPH oxidases[J].J Biol Chem,2008,283(25):16961-16965.

[2] Sumimoto H,Miyano K,Takeya R.Molecular composition and regulation of the NOX family NADPH oxidases[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,338(1):677-686.

[3] Juhasz A,Ge Y,Markel S.Expression of NADPH oxidase homologues and accessory genes in human cancer cell lines, tumours and adjacent normal tissues[J].Free Radic Res,2009,43 (6):523-532.

[4] Geiszt M,Lekstrom K,Brenner S,et al.NADPH oxidase l,a product of differentiated colon epithelial cells, can partially replace glycoprotein 91phox in the regulated production of superoxide by phagocytes[J].J Immunol,2003,171(1):299-306.

[5] Trachootham D,Alexandre J,Huang P.Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms:a radical therapeutic approach[J].Nat Rev Drug Discov 2009,8(7):579-591.

[6] Arnold RS,Shi J,Murad E,et al.Hydrogen peroxide mediates the cell growth and transformation caused by the mitogenic oxidase NOX1[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(10):5550-5555.

[7] Bedard K,Krause KH.The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases：physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2007,87(1):245-313.

[8] Chen L,Xu B,Chen L,et al.Cadmium induction of reactive oxygen species activates the mTOR pathway,leading to neuronal cell death[J].Free Radic Biol Med,2011,50(5):624-632.

[9] Lambeth JD.Nox enzymes, ROS, and chronic disease: an example of antagonistic pleiotropy[J].Free Radic Biol Med,2007,43(3):332-347.

[10]Gu Y,Xu YC,Wu RF,et al.TNF alpha activates c-Jun amino terminal kinase through p47(phox) [J].Exp Cell Res,2002,272(1):62-74.

[11]Madamanchi NR,Li S,Patterson C,et al.Reactive oxygen species regulate heat-shock protein 70 via the JAK/STAT pathway[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21(3) :321-326.

[12]Browatzki M,Larsen D,Pfeiffer CA,et al.Angiotensin II stimulates matrix metalloproteinase secretion in human vascuIar smooth muscle cells via nuclear factor-kappaB and activator protein 1 in a redox-sensitive manner[J].J Vasc Res,2005,42(5):415-423.

[13]Kamata T.Roles of Nox1 and other Nox isoforms in cancer development[J].Cancer Sci,2009,100 (8):1382-1388.

[14]Reuter S,Gupta SC,Chaturvedi MM,et al.Oxidative stress,inflammation, and cancer:how are they linked[J].Free Radic Biol Med,2010,49(11):1603-1616.

Expression of NADPH OxidaseNOX2 andNOX3 mRNAin Human Gastric Cancer

LI Hong-qian, CHANG Yong-chao, JIANG Ya-lin,et al

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003, China)

ObjectiveTo investigate the expression of NADPH oxidaseNOX2 andNOX3 mRNA in human gastric cancer tissues.MethodsFifteen samples from radical resection of gastric cancer, 15 samples from normal control group, and 20 biopsies from chronic gastritis patients were collected from the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology.NOX2 andNOX3 mRNAs were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression ofNOX2 andNOX3 mRNAs were significantly increased in the gastric cancer compared to non-cancerous tissues and specimens of chronic gastritis. There was no significant difference inNOX2 mRNA expression between tumor-matched normal mucosa and tissue of chronic gastritis, and the expression ofNOX3 mRNA was also very low.ConclusionNADPH oxidase ofNOX2 andNOX3 may play an important role in the process of the occurrence and development of gastric cancer.

NADPH oxidase；NOX2；NOX3；gastric cancer；chronic gastritis

国家自然科学基金(No.81370487)

2015-01-11

河南科技大学第一附属医院，河南洛阳471003

李宏谦(1982-)，男，河南清丰人，硕士研究生在读，从事消化系统疾病的临床检验和诊断学研究。

高强，男，博士，主任医师，硕士生导师，E-mail：gaoq37@yeah.net

R573.9

A

1672-688X(2015)01-0001-03