不同光质对铁皮石斛原球茎增殖及有效成分含量的影响

林小苹 赖钟雄

摘  要  以铁皮石斛的原球茎、无根苗（无根试管苗）、茎段和叶片为材料，研究不同光质条件对铁皮石斛原球茎增殖及4种材料中多糖和生物碱含量的影响。结果表明，在绿光下原球茎的增长率明显低于其他光质，在白光和蓝光下原球茎的增长率较好;在4种材料中，蓝光能促进生物碱的合成，有利于生物碱积累，而红光能促进碳水化合物的积累，有利于多糖含量增加，绿光则不同程度地抑制多糖和生物碱的积累。

关键词  铁皮石斛;光质;原球茎增殖;有效成分含量

中图分类号  R282;R931          文献标识码  A

Effect of Light Quality on the Proliferation of Protocorm and

Active Ingredient Contents of Dendrobium officinale

LIN Xiaoping1，2， LAI Zhongxiong2 *

1 Zhangzhou City Professional College， Zhangzhou， Fujian 363000， China

2 Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  The protocorms， plantlets（without roots）， stem segments and leaves were used as the materials for messuring the proliferation of protocorm， polysaccharide content and alkaloid content in different light quality in Dendrobium officinale. The results showed that the proliferation of protocorm in green light condition was significantly lower than those of other groups， while that was better in white and blue light condition; Blue light could promote the synthesis of alkaloids and was advantageous to the alkaloid accumulation; Red light could promote the accumulation of carbohydrates and was advantageous to the polysaccharide content increased; Green light in different degrees suppressedf polysaccharide and alkaloid accumulation in the four materials.

Key words  Dendrobium officinale; Light quality; Proliferation of protocorm; Active ingredients  content

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.012

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属植物，是我国传统名贵中药材之一，含有多糖、生物碱等多种人体所需的有益成份。目前，铁皮石斛的组织培养普遍采用日光灯为光源，其光谱有很多植物生长不必要的波长并存在发热浪费能源等问题。光照是植物生长的主要影响因素之一，其中光质对植物的光形态建成起着重要而复杂的调控作用。由于光调控的复杂性及次生代谢产物形成和积累的特异性，使同一个体不同部位及发育时期次生代谢产物的含量具有一定的差异性。多名学者对多糖及生物碱在铁皮石斛中分布规律进行研究，发现铁皮石斛有效成分含量的多少与其培养的不同阶段和取材部位有关。除了石斛传统的入药部位——茎外，多项研究发现石斛类植物原球茎、根和叶中也含有较高的多糖及生物碱[1-8]。因此，通过探究不同光质条件下铁皮石斛生长及生物碱和多糖含量的变化，确定促进铁皮石斛生长及体内有效成分含量增加的最佳光质，对研究石斛类植物具有重要的意义。

1  材料与方法

1.1  材料

在白光（W）、红光（R）、蓝光（B）和绿光（G）4种不同光质下培养的铁皮石斛原球茎及试管苗。光照使用的各种光源均系冷光源，主要技术参数见表1。每天光照15 h，培养温度：25 ℃。

1.2  方法

1.2.1  不同光质对原球茎增殖的影响   以铁皮石斛原球茎为材料，每瓶接入5团原球茎，每个处理10瓶，3次重复。每20 d测定1次鲜重，按以下公式计算增殖率。

增殖率=[（培养后的鲜重-接种时的鲜重）/接种时的鲜重]×100%

1.2.2  不同光质对试管苗生长的影响   以铁皮石斛长约0.5～1 cm的茎段为材料，每瓶接10个茎段，常规诱导培养40 d后，选择生长状态一致的芽苗转入继代培养基，放在不同光质条件下培养，每瓶接10个芽苗，每个处理5瓶，3次重复。

株高（茎基部到茎最高点）、最大叶宽（每株最大叶的最宽处）和最大叶长（每株最大叶的最长处）用游标卡尺测量，精度0.001 cm;数据分析运用DPS软件进行单因素方差分析，叶片颜色、健壮度、长势等外部形态特性用描述法。

1.2.3  不同光质对多糖含量的影响   参照李彩霞等[9]的方法，提取在不同光质条件下培养60 d的铁皮石斛原球茎、无根苗（无根试管苗）、茎和叶4种材料的多糖，测定其百分含量。

（1）标准曲线绘制。准确吸取葡萄糖标准溶液10、20、40、60、80和100 μL，分别置10 mL容量瓶中，加蒸馏水至2.0 mL，各加5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，25 ℃水浴放置25 min。另以2 mL蒸馏水同法操作作为空白对照。于490 nm处测吸光度，绘制标准曲线方程式为C=144.85A-0.306 1（R2=0.999 6）。葡萄糖在6.36～25.49 μg范围内呈线性关系。

（2）样品溶液制备与测定。精确称取样品约0.5 g（精确度0.001 g），放入50 mL容量瓶中，加30 mL蒸馏水，超声波（功率120 W，频率40 kHz）处理20 min后定容至刻度。自然沉淀1 h，取上清液2 mL，加无水乙醇8 mL，混匀放置0.5 h。离心机3 000 r/min离心20 min。弃上清液，沉淀加蒸馏水混匀，定容至25 mL备用。吸取备用液0.5 mL，与标准曲线同法操作，490 nm处测定吸光度，查标准曲线得样品溶液中葡萄糖含量（μg）。再按下式计算样品中多糖的百分含量。

X=■×100%

式中X为样品中多糖的百分含量;V1为样品定容体积（mL）;V2为样品定溶液取样体积（mL）;V3为沉淀定容体积（mL）;V4为测定用样液体积（mL）;W为样品重量（g）;C为标准曲线查得样品溶液中葡萄糖含量（μg）。

1.2.4  不同光质对生物碱含量的影响

（1）样品生物碱提取。取在不同光质条件下培养60 d的铁皮石斛原球茎、无根苗（无根试管苗）、茎和叶4种材料，50 ℃烘干备用。取样品粗粉0.5 g于平底烧瓶中，加入适量浓氨水润湿，密封放置30 min后加入10 mL氯仿，称重后放入水浴锅中加热回流2 h，冷却后再次称重并补充氯仿至原重，过滤，精密量取续滤液1 mL，用氯仿定容到10 mL，摇匀，从中吸取2 mL，加氯仿定容至25 mL，摇匀，即为样品待测液。同时，取石斛碱标准溶液（25 μg/mL）2 mL，加氯仿定容至25 mL，摇匀，即为生物碱标准液。

（2）标准曲线绘制。参考金蓉鸾等[10]的试验步骤，采用溴甲酚绿酸性染料比色法，在620 nm波长处测定吸光度，以石斛碱标准液的不同浓度为横坐标，不同浓度标准液的吸光度为纵坐标，得到标准曲线的方程为：A=0.075 5C+0.001（R2=0.999 7）。生物碱含量在1～5 μg/mL范围内符合比尔定律。

（3）样品生物碱含量测定。精确移取样品待测液各10 mL，与标准曲线同法操作，620 nm处测定吸光度。按以下公式计算总生物碱含量。

总生物碱含量=■×100%

2  结果与分析

2.1  不同光质对原球茎增殖的影响

由图1可见，不同光质下铁皮石斛原球茎的生长曲线均呈“S”型，绿光下各个阶段的增长率要明显低于其他3种光质。0～20 d为延迟期，这个时期的原球茎要适应新的环境，所以增长速度较为缓慢，不同光质之间没有明显区别。40～80 d，除绿光外，其他3种光质下的原球茎分裂旺盛，细胞生长迅速，较快进入指数生长期。其中，蓝光和白光下原球茎增殖率没有较明显的差异，红光居中，而绿光从60 d起才有一个明显的增长过程，增长率也较其他3种光质低。80 d后，蓝光和绿光下原球茎的生长进入静止期，原球茎细胞分裂、生长和增生减缓，趋于平稳，100 d后生长进入衰老期，而白光和红光下的原球茎仍有较缓慢的增长趋势。这说明蓝光在原球茎增长指数生长期有明显的促进作用，到静止期后作用减弱甚至有抑制作用，而红光和白光对原球茎的增长虽然没有蓝光那么强的促进作用，但作用时间长，从整体的量上来说三者是持平的。

2.2  不同光质对试管苗生长性状的影响

2.2.1  不同光质对试管苗株高的影响   运用DPS软件进行不同光质下试管苗株高的单因素方差分析，结果显示p值为0.000 1（表2），小于0.05，说明不同光质处理对铁皮石斛试管苗的株高具有显著性差异。

从表3的Tukey多重比较可看出，蓝光与红光和绿光处理之间的差距较大，平均株高变幅为2.046 3～5.318 7 cm，红光下的最矮，蓝光下的最高。红光和绿光下的差距较小。

2.2.2  不同光质对试管苗叶长的影响   运用DPS软件进行不同光质下试管苗叶长的单因素方差分析，结果显示p值为0.000 1（表4），小于0.05，说明不同光质处理对铁皮石斛试管苗的叶长具有显著性差异。

从表5的Tukey多重比较看出，最大叶长的变幅为1.03～3.99 cm，蓝光与其他光质处理之间的差距较大，红光和绿光下的差距较小。

2.2.3  不同光质对试管苗叶宽的影响   运用DPS软件进行不同光质下试管苗叶宽的单因素方差分析，结果显示p值为0.000 1（表6），小于0.05，说明不同光质处理对铁皮石斛试管苗的叶宽均具有显著性差异。

从表7的也可看出，绿光与其他光质处理差距较大，叶片最细，白光处理最宽。

2.2.4  不同光质对试管苗性状的影响   不同光质下铁皮石斛试管苗的外观表现差异显著（见表8）。结合叶色、健壮度等外观表现，白光下的优势比较明显，表现为叶色浓绿，茎粗壮;蓝光下的茎虽然粗稍逊于白光下的，但株高比白光下的高，叶片也较长，说明蓝光在一定程度上有利于铁皮石斛的长高及叶片的纵向生长，但白和蓝2种光质对丛生芽的增殖效果较弱;而红光抑制植株的长高但有利于茎的横向加粗及侧芽的形成，萌蘖能力更强;绿光虽然也能形成较多的小蘖苗，但形成的植株长势弱小，说明红和绿2种光质对丛生芽的增殖有促进作用，有利于短期获得大量的试管苗。

2.3  不同光质对有效成分的影响

运用DPS软件对不同光质下有效成分的含量进行显著性差异分析（表9）。从表9可以看出，不同光质下铁皮石斛有效成分含量存在显著差异。白光和红光下对无根苗和叶中生物碱含量的影响不显著，不同颜色光照射，对原球茎和茎中生物碱含量的影响差异较大;白光或红光照射，对无根苗中多糖含量的影响不显著，红光和蓝光照射，对原球茎中多糖含量没有显著影响，而不同颜色光照射，对茎和叶中多糖含量则影响显著。由表9还可见，生物碱对光质的响应趋势与多糖基本一致： 原球茎、茎和叶中均是白光下的最高，绿光下的最低，无根苗中是红光最高，绿光最低。

2.3.1  不同光质对多糖含量的影响   从图2可以看出，在不同光质下培养60 d后，4种材料内多糖含量的百分比大多呈现出“原球茎≥无根苗>叶>茎”的趋势，只有绿光下培养的材料，多糖含量的百分比趋势稍有区别，以叶片中的多糖含量最少;白光下培养的材料，除无根苗多糖含量稍低于红光下的外，其他3种材料均含量最高;绿光下培养的材料，多糖含量一直处于最低值，这说明白光和红光对铁皮石斛多糖合成有促进作用，而绿光则有一定程度的抑制作用。

2.3.2  不同光质对生物碱含量的影响   从图3可以看出，生物碱合成对光质的响应，表现为白光和蓝光下的生物碱含量明显较红光和绿光下的高，说明适当的蓝光可以促进生物碱的合成和积累，而绿光可能会减少生物碱合成前体物的供给，从而影响生物碱的合成，不利生物碱含量的积累。无论在何种光质下，生物碱含量基本都呈现“原球茎≥茎>叶>无根苗”的大体趋势，原球茎和茎中的生物碱含量较高。

3  讨论与结论

3.1  光质对植物生长发育的影响

植物正常的发育过程是一个光形态建成的过程，植物通过体内3种主要光受体：红光和远红光受体、蓝光受体、紫外光受体来感知不同波长的光信号，因此光质对植物的光形态建成起着重要的调节作用[11]。但是，光质对植物生长发育的调控又是一个非常复杂的过程，不同组织或器官对同一种光质的反应不尽相同，表现出光质生物学反应的复杂性。本研究的结果表明，4种不同光质下铁皮石斛原球茎的生长曲线均呈“S”型，蓝光对原球茎增长有明显促进作用，绿光下各个阶段的增长率要明显低于其他3种光质;白光在促进试管苗生长方面有比较明显的优势，蓝光虽然稍逊于白光，但在株高及叶的长势方面均比白光的高，而红和绿2种光质对丛生芽的增殖有促进作用，有利于短期获得大量的试管苗。这与车生泉等[12]、潘新仿等[13]和梁学芬等[14]的研究结果基本一致。但与Moe等[15]、李韶山等[11]和贾书华[16]等的研究结果又有不同，他们的研究认为光质在抑制茎的伸长方面，红光与蓝光都有显著效果。究其原因，与光质对植物体内生长素（如赤霉素、吲哚乙酸）的含量、吲哚乙酸氧化酶的活性、诱导原生质体收缩反应等因素有关。

3.2  光质对有效成分合成的影响

影响植物体内有效化合物含量的因素很多，如生长状态，光照、温度和提取方法等内、外因素。资料表明[7]，铁皮石斛不同部位的生物碱含量各不相同，呈现茎上段>叶>茎中段≈茎下段的规律;而且不同干燥方法处理的铁皮石斛，各部位的生物碱含量会发生了一定变化，与晒干处理相比较，杀青烘干处理的铁皮石斛，茎上段和根部的石斛碱含量均下降，而茎中下段和叶等其他部位的生物碱含量则提高了。与光合产物多糖相比，生物碱作为一种次生代谢产物，分布有局限性，仅出现在某些特化的器官、组织或细胞中。在离体培养条件下，受内外因素影响，不同部位的细胞或组织内在生理生化特性发生相应的变化，从而使细胞合成某种化合物的能力被激活或丧失，导致次生代谢含量产生提高或下降的变化。本试验中生物碱含量呈现“原球茎≥茎>叶>无根苗”这一趋势的原因，是否与在铁皮石斛的衰老死亡过程中，生物碱在不同部位会发生了运输转移有关。

环境因子变化可诱发植物碳代谢途径的转变[17-20]，目前光质对植物生长及有效成分含量的影响大家已经达成一定的共识。有较多资料表明，光质对高等植物的碳水化合物和蛋白质代谢有调节作用。对番茄[21]、水稻[22]、水母雪莲[23]、铁皮石斛[24-25]、霍山石斛[16]等多种植物的研究发现，红光能促进植物体内碳水化合物的积累，蓝光能提高蛋白质的含量。生物碱是植物体内一种碱性的含氮有机化合物，而多糖是细胞中碳水化合物的一种。本试验结果也证明蓝光能促进生物碱的合成，有利于生物碱积累，而红光能促进植物体内碳水化合物的积累，有利于多糖含量增加，绿光不同程度地抑制多糖和生物碱在植株中的积累，这与侯甲男[24]、高亭亭等[25]及贾书华[16]的研究结果是一致的。高建平等[26]通过免疫药理的研究发现，铁皮石斛原球茎与原药材作用相似，均能提高机体的非特异性免疫功能和细胞免疫功能。本试验的研究表明，铁皮石斛原球茎内多糖及生物碱的含量均比试管苗高，这与张冬青等[27]、黄民权等[28]的结果也一致。这初步证明可以通过选择合适的光质来提高原球茎次生代谢产物的积累，以组织培养获得的铁皮石斛原球茎代替其野生品是解决铁皮石斛资源紧缺的有效途径。

近年来，光质对铁皮石斛试管苗农艺性状及有效成分的影响仅仅处于探究阶段，还没有真正在生产中应用。在栽培实践中，国内外出现了一种新型转光农膜[29]，铁皮石斛作为阴生植物，在大棚栽植阶段能否用不同色膜覆盖，在避雨和遮阳的同时提高铁皮石斛的质与量，也是一个可以进行探究的问题。因此，利用铁皮石斛组织培养体系，进行不同光质处理，探究如何提高其生长速率和有效成分的积累，既可以直接用于铁皮石斛制品的生产，也能指导铁皮石斛的野外田间栽培，提高其产量和质量，以满足不断扩大的市场需求，提高经济效益。

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