铁皮石斛茎尖诱导原球茎再生体系的研究

王波　崔翠　顾颖慧

摘 要 以铁皮石斛茎尖为外植体进行高效再生体系建立实验，采用单因素实验研究不同基础培养基、激素浓度的配比、天然添加物对原球茎诱导、增殖、分化的影响，筛选出适合各培养阶段的培养体系配方，建立铁皮石斛组织培养快速繁殖体系

关键词 铁皮石斛；原球茎诱导；快繁体系

中图分类号：S682.31 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）18-00-03

铁皮石斛（Dendrobium candidum），又称黑节草，云南铁皮，兰科多年生附生草本植物，道家养生经典著作《道臧》誉其为“中华九大仙草之首” [1]。由于人们对野生铁皮石斛的过度采挖，使得其野生资源已濒临灭绝，而铁皮石斛的种子极小且无胚乳，自然条件下萌发率极低，实生苗人工栽培相对比较困难；并且传统的分株、扦插等繁殖方式生长周期长，繁殖率低，远不能满足生产上的需要[2]。为此，开展铁皮石斛的组织培养研究成为必然。目前，有关铁皮石斛组织培养成功的报道很多[3]。在铁皮石斛再生体系技术研究中，原球茎诱导是整个再生的体系中开始的环节，其诱导率的高低直接影响瓶苗的出苗率、生产成本。本研究以铁皮石斛无菌苗作为外植体，对茎尖诱导原球茎的增殖和分化进行系统研究，以基础培养基、激素的浓度配比和天然添加物为因子，采用正交试验筛选出最优的培养基配方，以期缩短组培苗生长周期、提高组培苗质量和移栽成活率，为人工规模化繁殖和栽培提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用潍坊工程职业学院花卉研究所培育的铁皮石斛无菌苗作为组织培养的外植体材料

1.2 实验方法

选取健壮无污染的组培苗，在解剖镜下仔细剥离茎尖，逐层剥去外围组织，用解剖刀切取0.1～0.2 mm的茎尖，分别接种到诱导培养基中，经过一段时间的诱导，外植体膨大产生原球茎。将产生的原球茎转入增殖培养基和分化培养基，经原球茎的增殖和分化形成新的植株。人工气候培养箱培养，培养条件：温度（25±1）℃，湿度为75%，光照强度为2 000 lx，时间12 h/d。

2 结果与分析

2.1 原球茎的诱导

以茎尖为外植体诱导原球茎的发生阶段做三因素三水平正交试验（表1），将切取的茎尖接种到不同配方的培养基中，每瓶接种4个茎尖，每个处理接种5瓶，重复3次。基本培养基：MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。培养期间定期观察原球茎诱导情况，培养30 d后统计诱导率。对照不加激素和天然添加物，试验结果表明（表2），在不添加激素和天然添加物时，外植体的诱导率为13.3%，当添加不同浓度的激素和天然添加物后原球茎的诱导率均有所上升。并且极差分析表明在所设置的3个因素中6-BA对试验结果的影响比较明显，其次为天然添加物椰肉和NAA。综合分析极差结果，该试验最佳培养基配比为：MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。

表1 L9（34）正交试验因素水平设计

因素

水平 A B C

NAA/（mg/L） 6-BA//（mg/L） 椰肉/（g/L）

1 0.1 0.2 5

2 0.2 0.5 10

3 0.5 1.0 15

表2 L9（34）正交试验结果分析

试验号 A B C 诱导率/%

CK 0 0 0 13.3

1 1 1 1 31.7

2 1 2 2 41.7

3 1 3 3 35.0

4 2 1 3 31.7

5 2 2 1 43.3

6 2 3 2 38.3

7 3 1 2 31.7

8 3 2 3 35.0

9 3 3 1 35.0

K1 108.4 95.1 110 -

K2 113.3 120 116.7 -

K3 101.7 108.3 91.7 -

k1 36.1 31.7 36.7 -

k2 37.8 40.0 38.9 -

k3 33.9 36.1 33.9 -

R 3.9 8.3 5.0 -

2.2 原球茎的增殖

将上述试验中相同条件下生长良好的原球茎，切割成直径约1.0 cm×1.0 cm小块接种到不同激素和天然添加物配比的培养基中，每瓶接种4块，60 d内统计原球茎的增殖情况。基本培养基。1/2MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、椰乳为因素设计四因素三水平的正交试验（表3）。

原球茎培养7 d后，增殖现象开始明显，新增原球茎淡黄绿色；30 d原球茎增殖加快；60 d后部分原球茎少部分出现黄化现象。9 组试验原球茎增殖倍数和生长状况都出现差异（表4），试验组5号、6号、9号原球茎生长紧致，颜色绿色，增殖倍数较大；试验组1号、4号和7号原球茎的增殖倍数较低，生长后期出现黄化坏死现象。极差分析结果表明NAA、6-BA、KT、椰乳四个对试验结果影响顺序为6-BA>NAA>KT>椰乳，最适实验组合为B2A2C2D3。综合原球茎增殖倍数及生长状况，增殖最适培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。

表3 不同激素和天然添加物因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 椰乳/（g/L）

1 0.2 1.0 0 5

2 0.5 1.5 0.5 10

3 1.0 2.0 1.0 15

2.3 原球茎的分化

将上述增殖试验中生长一致且状态健壮的原球茎，切割成直径约1.0 cm×1.0 cm小块接种到不同激素和天然添加物配比的分化培养基中，每瓶接种4块，每种处理接5瓶，30 d统计原球茎的分化情况。基本培养基：MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、马铃薯提取物为测试因素设计四因素三水平的正交试验（表5）。在设置的9组试验中原球茎的分化出现了明显的差异（表6），试验组5号、6号原球茎分化率最大； 试验组1号、2号和3号分化率较低。极差分析结果表明NAA、6-BA、KT、马铃薯提取物四个对试验结果影响顺序为NAA>6-BA>KT>马铃薯提取物，最适实验组合为A2B1C2D3。原球茎最适分化培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。

表5 原球茎分化培养基因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 马铃薯提取物/（g/L）

1 0.5 1.0 0 50

2 1.0 1.5 0.1 100

3 1.5 2.0 0.5 150

（上接第页）

3 结论

自然状态下，铁皮石斛的种子极小，繁殖率低，用组织培养方法快速繁殖大量试管苗，是解决种苗最有效的途径之一[4]。本研究综合各试验阶段初步建立了一套较完整的铁皮石斛组织培养繁殖体系。以茎尖为外植体分别研究了不同激素配比和天然添加物对铁皮石斛原球茎的诱导、增殖和分化的影响。从中比较和筛选出适合不同培养阶段的培养基配方。结果表明，茎尖诱导原球茎的最适诱导培养基为MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，原球茎增殖培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。原球茎分化培养基为MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。在本试验体系中原球茎的分化率最大可以达到93.3%，这为铁皮石斛规模化生产提供了更加有力的保障。

参考文献

[1][魏]吴普，等述.神农本草经[M].[清]孙星衍，等辑.北京：人民卫生出版社，1982：21.

[2]徐路加，华允芬.石斛原球茎的组织培养研究进展[J].北方园艺，2014（6）.

[3]王丽萍，梁淑云.铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究[J].中国农学通报，2010（1）.

[4]张启香，付素静，方炎明，等.铁皮石斛拟原球茎的发生过程[J].浙江林学院学报，2009（3）.

（责任编辑：刘昀）