采收期对阿克苏地区灰枣cAMP含量的影响研究

史洪君　刘琦　孟潇等

摘要[目的] 研究测定灰枣cAMP含量的新方法及灰枣采收期对其cAMP含量的影响。[方法]以阿克苏地区灰枣为研究对象，建立了HPLC法测定灰枣中cAMP含量的定量测定方法，并对不同采收时期的灰枣及其制干产品的cAMP含量进行了测定。[结果]试验表明，HPLC测定cAMP含量的色谱条件为：选用Inertsil ODS3色谱柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的浓度为0.167 8%甲酸溶液为流动相、柱温30 ℃、流速 0.8 ml/min、检测波长254 nm测定灰枣中的cAMP含量，cAMP浓度在1.0～100.0 μg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系，R2=0.999 0，且其精密性高、重现性好、加标回收率高（>98%， RSD值为1.38%）。灰枣采收时期对鲜枣及其制干产品的cAMP含量有显著影响（达到0.01显著水平）。

[结论]阿克苏地区灰枣在10月24日至10月31日期间采收，有利于保持较高的cAMP含量，此期采收的鲜灰枣及其干枣的cAMP含量分别为75.237和294.097 μg/g左右。 研究可为新疆阿克苏地区红枣产业化发展提供科学参考。

关键词灰枣；采收时间；环磷酸腺苷；HPLC

中图分类号S665.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-291-03

Influence of Harvest Time of Huizao Jujube on Their Content of cAMP in Aksu Area

SHI Hongjun， LIU Qi， MENG Xiao， XIANG Yanju*

（College of Life Science， Tarim University/ Xinjiang Production & Construction Corp Key Laboratory for Advanced Processing of Local Agricultural Products in Southern Xinjiang， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract[Objective] To develop new method for determination of cAMP content in Huizao jujube， and study effects of harvest time on cAMP content. [Method] With Huizao jujube in Aksu area as research object， the HPLC method was established for determination of cAMP content， cAMP content in Huizao jujube and its dried products in different harvest time was determined. [Result] The results as follows： the appropriate method with HPLC， were using Inertsil ODS3 column（4.6×250×5 μm）at 30 ℃ as stationary phase， using solution composed of methanol0.167 8% formic acid （10∶90）as mobile phase， detection wavelength at 254 nm， and flow rate with 0.8 ml/min. There was a good linear relationship between the concentration of cAMP and area integral value in the range of 1.0-100.0 μg/m， R2=0.999 0. The average recovery was over 98.0% with RSD=1.38. There was significant impact at 0.01 significant level between harvest time of Huizao jujube and their content of cAMP in fresh and dry fruits in Aksu Area.

[Conclusion] The appropriate harvest time was on between October 24 and 31 to obtain higher content of cAMP in Aksu Area， which was 75.237， 294.097 μg/g or so respectively. The study can provide scientific reference for Huizao jujube industrial development in Aksu Area.

Key wordsZizyphus jujube cv. Huizao； Harvest time； Adenosine cyclic 3，5monophosphate； HPLC

基金項目塔里木大学校长基金（TDZKSS201421）；国家级大学生创新训练项目（201410757013）。

灰枣（zizyphus jujube cv.huizao）质地致密，可溶性固形物含量高（达30%），可食率97%以上，属于优质的鲜食兼制干品种。灰枣自20世纪70年代初从河南新郑引种到新疆，已成为新疆发展红枣产业的主导品种，也是阿克苏地区红枣主栽品种[1]。该区灰枣水分含量低，总糖含量高，含有丰富的VC、环磷酸腺苷（cAMP）及必需氨基酸，营养价值高[2]。灰枣中不仅含有丰富的营养成分，更含有极为丰富的生物活性成分，cAMP 就是其中之一。临床医学研究证明，cAMP 能舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、激活蛋白，并对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癣等疾病有显著疗效[3]。枣中cAMP含量的检测方法多是采用高效液相色谱法[4-6]。蒲云峰等用HPLC法测定了骏枣、冬枣、灰枣、葫芦枣的cAMP含量，发现不同品种间cAMP含量差异较大，以灰枣含量最高，为（0.450±0.047）mg/g[7] 。而现有HPLC法测定cAMP含量时，使用的流动相极大多数为甲醇和一定浓度的磷酸二氢钾水溶液。

除鲜食枣在脆熟期采收外，晾制干枣的都要在完熟期采收[8]。陈德廷等研究发现，不同采收期对商品干枣的单果重、枣果等级、商品干枣的产量、质量和经济效益影响极大[9]。史彦江等对环塔里木盆地的骏枣的适宜采收期进行研究，结果表明，枣果干物质积累随采收期的延迟表现出先增加后停止的现象；其总糖含量和糖酸比，在10月5日时达最高值，其后呈降低趋势，而总酸含量则随采收期的延迟基本表现递增的现象；不同地区的骏枣采收期有所不同，新疆于田县试点及其相似区域，骏枣适宜采收期在10月15日左右，而新疆阿克苏市、新和县试点及其相似区域，适宜采收期宜则在10月20日左右[10]。

笔者以阿克苏地区灰枣为研究对象，研究利用HPLC法测定灰枣cAMMP含量的新方法，并就灰枣采收期对其cAMP含量的影响进行研究，以期为该地区红枣产业化发展提供科学参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试原材料。灰枣，采自塔里木大学校办农场4年生灰枣园。采收时期：自9月19日始，每隔6～7 d采果一次，至11月7日止，共采枣8次，采枣时间为18：00左右。采收方法：选健壮、丰产的枣树20棵，在每株树上分不同时期采收鲜枣，每次每株采40个枣果，采收时在所选的枣树上打好标记，并固定枝条作为采收枝。首次采收时，从枝条顶部第1个二次枝采摘，每间隔5～6个二次枝采摘1个二次枝上的所有枣果，依此类推。后期采摘树上所标枝条枣果不足时，从对应枝树下拾取不足部分。采后的枣及时置于4～5 ℃冷库中预冷。

干制灰枣：按GBT 5835-2009 干制红枣执行。将采后经预冷的灰枣于50 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，至其水分含量在22%～25%时干燥终止。

1.1.2主要試剂。

cAMP标准品（纯度>99%），Ruibio进分，合肥博美生物科技有限责任公司；

甲醇（纯度=99.9%），色谱纯，SigmaAldrich；甲酸，分析纯，天津市富宁精细化工有限公司；

娃哈哈饮用纯净水，石河子娃哈哈食品有限公司。

1.1.3主要仪器。

岛津LC20A高效液相色谱仪，日本岛津制作所；FA2104N电子天平，上海菁海仪器有限公司；KQ3200DV型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GL20GII 型超速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；UPSⅢ10T优惠超纯水制造系统，成都超纯水科技有设公司；GZX9420MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司。

1.2方法

1.2.1红枣cAMP提取样液制备方法。

1.2.1.1鲜枣cAMP提取样液制备方法。

准确称取鲜枣5 g，去皮去核后放入研钵研磨至匀浆，然后加入30 ml超纯水将其全部转移至三角瓶中，超声提取30 min后，4 800 r/min离心30 min，取上清液。残渣重复提取一次（加入20 ml超纯水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至50 ml，于4 ℃冰箱冷藏备用。将枣样液过0.45 μm针式滤头得使用液，注入样品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.1.2干枣cAMP提取样液制备方法。

准确称取鲜枣2 g，去皮去核后放入研钵研磨至匀浆，然后加60 ml超纯水将其全部转移至三角瓶中，超声提取30 min后，4 800 r/min离心30 min，取上清液。残渣重复提取一次（加入40 ml超纯水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至100 ml，于4 ℃冰箱冷藏备用。将枣样液过0.45 μm针式滤头得使用液，注入样品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.2标准品溶液的配制。

1.2.2.1标准品储备液的配制。

准确称取0.012 9 g环磷酸腺苷标准品，用超纯水定容至10 ml，得1.29 mg/ml的cAMP标准品贮备液。

1.2.2.2标准品使用液的配制。

精确吸取0.387 597 ml环磷酸腺苷标准品贮备液于5 ml容量瓶中，用超纯水定容至5 ml，得100 μg/ml标准溶液使用液；再依次从制得的100、50、10、5、2 μg/ml标准溶液使用液中吸取2.5、1.0、2.5、2.0、2.5 ml于5 ml容量瓶中并定容，制得50、10、5、2 和1.0 μg/ml标准溶液使用液。滤液于4 ℃冰箱冷藏，用前过0.45 μm针式滤头。

1.2.3色谱条件。

色谱柱：Inertsil ODS3，4.6×250×5 μm；柱温：30 ℃；流速：0.8 ml/min；波长：254 nm；进样量：10 μl；流动相A：10%色谱甲醇，流动相B：90%的浓度为0.167 8%的甲酸溶液（即将1 ml甲酸溶于一瓶容积为596 ml的娃哈哈纯净水）。

1.2.4方法测试。

按照上述色谱条件，将浓度为5、10 μg/ml的处理好的cAMP标准品溶液放入自动进样器，扫描结果见图1和图2。从图1～2可知，cAMP标准品在保留时间为14.445 min时有最大吸收峰出现，且该峰随浓度增加，吸收峰高度及峰面积也增加，表明利用此法测定cAMP含量时其保留时间为14.445 min。

图15 μg/ml cAMP标准品的HPLC色谱

图210 μg/ml cAMP标准品的HPLC色谱

1.2.5枣中cAMP含量的计算公式。计算公式如下：

X=C×V/M

式中，X为待测红枣样品的cAMP含量（μg/g）；

C为 HPLC法测得的红枣cAMP提取样液中的cAMP浓度（μg/ml）；

V为制备红枣cAMP提取样液时定容的体积（ml）；

M为红枣的质量（g）。

2结果与分析

2.1标准曲线的建立

分别吸取10 μl cAMP 标准使用液，注入高效液相色谱仪，测定其峰面积。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得图3，并计算得回归方程y=28 159x-19 592，R2=0.999 0。

图3cAMP 标准曲线

2.2精密性试验

将制备的红枣样品溶液过0.45 μm滤膜后放入样品瓶中，准确量取红枣样品溶液10 μl，用HPLC法测定其峰面积，从而确定cAMP含量。连续进样测定5次，结果见表1。计算得其RSD值为0.105 0%，表明该方法精密性良好。

表1精密度试验

试验号测提样品液的峰面积样液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1862 16831.3131.490.105 0

2866 98031.48

3868 43731.53

4869 59131.57

5868 84531.55

2.3重现性试验

将制备的红枣样品溶液贮藏于4 ℃冰箱中，6 d后取出，过0.45 μm滤膜后，分别量取1.5 ml置于5个样品瓶中；再准确量取红枣样品溶液10 μl，用HPLC法测定其峰面积，以确定cAMP含量，结果见表2。计算得其RSD值为1.78%，表明该方法重复性好。

表2重现性试验

试验号测提样品液的峰面积样液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1749 69927.3230.471.78

2874 49831.75

3854 06631.02

4858 00931.16

5856 87431.12

2.4回收率试验

将已经测定了含量的红枣样品过0.45 μm的滤膜后，精密量取 1 ml置于5 个样品瓶中，再加入浓度为10 μg/ml 的cAMP标准品溶液 1 ml，摇匀后，进样 10 μl，HPLC测定峰面积，计算回收率，结果见表3。由表3可知，用此色谱条件测定cAMP含量，其回收率超过98%，回收率RSD值为1.38%，表明该方法测定 cAMP含量时的回收率较好，方法可行。

表3加标回收率试验结果

试验号样液中cAMP含量∥μgcAMP加入量∥μgcAMP测定量∥μg回收率∥%平均回收率∥%RSD∥%

131.481041.2898.098.061.38

231.481041.3598.7

331.481041.2097.2

431.481041.1296.4

531.481041.48100

2.5采收期对灰枣及其干制品cAMP含量的影响

将样品使用液按照“1.2.3”的色谱条件测定其含量，并按“1.2.5”中公式计算枣中的cAMP含量，结果见图4。

图4灰枣采收期对其cAMP含量的影响

由图4可知，阿克苏地区所产灰枣，自9月20日起至11月7日止，其鲜枣中cAMP含量在25.20～78.024 μg/g。在10月24日前随着采收期的延迟，其含量逐渐升高，但在10月24日后其含量变化不大；而不同采收期的灰枣经干制后，其含量先逐渐升高，到10月24达到最高值294.097 μg/g，随后再逐渐降低。从不同采收期的鲜枣及制干后干枣的cAMP含量来看，阿克苏地区灰枣以10月24日至10月31日期间采收，有利于保持较高的cAMP含量。

经对采收时间、鲜枣的cAMP含量和干枣的cAMP含量进行相关性分析，结果见表4。由表4可知，采收时间对鲜枣的cAMP含量和干枣的cAMP含量的影响，以及鲜枣的cAMP含量与干枣的cAMP含量之间都达到0.01极显著相关水平。

表4采收时间、鲜枣的cAMP含量、干枣的cAMP含量三者间的相关性

项目采收时间鲜枣的cAMP含量干枣的cAMP含量

采收时间10.969**0.838**

鲜枣的cAMP含量0.969**10.931**

干枣的cAMP含量0.838**0.931**1

注：**表示在0.01水平（双侧）上显著相关。

43卷16期

史洪君等采收期对阿克苏地区灰枣cAMP含量的影响研究

3结论

通过试验，获得了HPLC测定cAMP含量的色谱条件为：选用Inertsil ODS3色谱柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的浓度为0.167 8%甲酸溶液为流动相、柱温30 ℃、流速 0.8 ml/min、检测波长254 nm测定灰枣中的cAMP含量，cAMP浓度在1.0～100.0 μg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系，R2=0.999 0，且其精密性高、重现性好及加标回收率高（>98%，RSD值为1.38%）。

红枣采收时期对鲜枣及制干后干枣的cAMP含量有显著影响（达到0.01极显著水平）；阿克苏地区灰枣在10月24日至10月31日期间采收，有利于保持较高的cAMP含量，此期采收的鲜灰枣cAMP含量在75.237 μg/g左右，制得的干枣cAMP含量在294.097 μg/g左右。

参考文献

[1] 牛攀新，袁火霞，楚光明.新疆南疆地区灰枣矮、密、早丰产栽培技术[J].北方园艺，2009（12）：155-157.