华山松松塔提取物抗HIV活性部位中铅含量的测定

张桢 孙帮燕 郭贵唐 罗建蓉

摘要[目的]为了分析华山松松塔提取物抗HIV活性部位中铅含量。[方法] 应用石墨炉原子吸收光谱法，参照中华人民共和国药典2010版[附录Ⅸ B 铅、镉、砷、汞、铜测定法（一部）]测定活性部位中铅含量。[结果]活性部位中铅含量在中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》和《中国药典》规定范围（Pb≤5.0 mg/kg ）之内，没有超标。[结论]该方法简单、方便、快速、灵敏，为抗HIV活性部位重金属铅含量测试提供一种可靠的方法。

关键词 含量测定； 铅； 抗HIV活性部位；华山松； 石墨炉原子吸收光谱法

中图分类号 S791.241文献标识码 A文章编号 0517-6611（2015）11-001-02

病原体为人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）的疾病，临床上称其为获得性免疫缺陷综合症（Acquiredimmune deficiency syndrome/AIDS）。如果机体感染HIV，那么机体的免疫细胞功能将会衰退且免疫细胞数量会衰退，导致机体增加恶性肿瘤发生机率或感染，最终导致感染者死亡。HIV不仅严重威胁着人类的健康，而且阻碍全球经济和社会的发展[1]。目前，尽管美国批准上市的HIV的药物有20多种，但是价格昂贵、毒副作用大，作用环节单一，易出现耐药性[2-3]。

松科松属植物资源丰富，全世界约100多种。我国松属植物分布极广，合计50余种（有22种，10个变种，引进16种，2个变种）[4]。据《本草纲目》记载，松塔具有祛痰、祛风、止咳平喘、安神和润肠等功效[5]。在我国，已有13种被列入药用的松属植物，其能入药部位主要为松塔及松子、松针、松脂、松节等。从目前松塔研究报道中发现，松塔中含有多糖、酚类、木质素类、萜类、黄酮类多种化学成分，且发现松塔药理活性具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、增强免疫力等作用[6-8]。

尽管中华人民共和国药典把13种松属植物列入药用，但目前报道松属的松塔药用开发不是很多，尤其关于松塔抗HIV药用的研究报道很少[9]。为此，笔者对采集于云南省巍山县的华山松（Pinus armandii Franch.）松塔进行研究，测定松塔提取物中（抗HIV治疗指数>30）铅的含量，为进一步研究抗HIV药物质量标准打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取干燥的华山松（P. armandii Franch.）松塔（生药学马晓宽教授鉴定）5 kg，粉碎，用一定浓度的乙醇（90%）在室温条件下提取2次（2×9 L），每次12 h。过滤，残渣用水浸泡提取，过滤后残渣中加碱液（浓度4%氢氧化钠）浸泡提取，过滤，向得到的碱性滤液加入酸（用乙酸调pH），浓缩到适量体积，加入乙醇混匀，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅰ；在滤液中继续加醇液，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅱ；滤液中再加醇液，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅲ。

1.2 试验方法

1.2.1测定条件。波长为283.1 nm[5]；背景校正为塞曼效应；狭缝0.7 nm；样品进样量17 μl，0.5%基体改进剂硝酸镁和硝酸钯的混合液3 μl，高纯氩气为保护气（250 ml/min）。升温程序（表1）： 第1次干燥温度110 ℃， 坡升时间1 s， 持续时间30 s；第2次干燥温度130 ℃， 坡升时间15 s， 持续时间30 s；灰化温度850 ℃，坡升时间10 s，持续时间20 s；原子化温度1 600 ℃，坡升时间0 s，持续5 s；净化温度2 450 ℃，坡升时间1 s，持续时间3 s。

1.2.2铅标准储备液和标准使用液的制备。

精密量取铅单元素标准液（GB08619）适量，用浓度2%硝酸溶液稀释，即得1 μg/ml铅标准储备溶液，冰箱中0～5 ℃保存[5]。精密量取铅标准储备液适量， 用浓度2%硝酸溶液稀释，配制400 ng/ml标准使用液（用时现配）。

1.2.3标准曲线的制备。 分别精密量取铅标准使用液0、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 ml于25 ml容量瓶中，用浓度2%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得0、5、10、20、40、80、160 ng/ml的溶液。按“1.2.1”用自动进样器自动进样，于石墨炉原子吸收光谱仪上测试。扣除试剂空白，以吸光度值（A）对铅浓度（C， ng /ml）做线性回归处理，回归方程为：A=0.002 85C+0.003 93，相关系数（r）=0.999 0，线性范围为0～200 ng/ml。

1.2.4样品测定。

参照中华人民共和国药典[2010版附录Ⅸ B 铅、镉、砷、汞、铜测定法（一部）（B法）]处理标本[5]，分别精密称取3种抗HIV活性部位（治疗指数>30）[4]样品0.20g，置三角瓶中，加硝酸/高氯酸（4∶1）10 ml，瓶口加一小漏斗，浸泡过夜，在通风厨里置电热板上加热消解，保持微沸，直至浓烟散尽，消解液呈透明，再加去离子水，待白烟散尽，定容至25 ml。同时，制备空白液，按测定条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1精密度试验。取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，重复测定吸光度6次。表2表明，样品Ⅰ～ⅢRSD分别为1.50%、1.77%、1.53%，说明该方法精密度良好。

2.1.2稳定性试验。取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，按“ 1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，每隔20 min测定一次吸光度。表3表明，2 h内颜色变化较小，不影响测定。

2.1.3回收率试验。采用加标回收法，取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，加入 0.5～2.0倍标准品，按“1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，测定其吸光度，并且计算回收率。表4表明，平均回收率为99.79%，RSD为4.45%。

2.1.4方法检出限。参照中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[10]，该法检出限为5.0 μg/kg。

2.1.5评价结果。采用《中国药典》[5]（2010年版）和中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[10]重金属最高限定的标准评价。

结果表明，提取物Ⅰ～Ⅲ 铅含量分别为3.41、2.71、2.92 mg/kg，低于中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（Pb≤5.0 mg/kg）和《中国药典》（2010年版）重金属最高限定的标准（Pb≤5.0 mg/kg）；超标率为0。

3 讨论

在取样和样品消解过称中，所有玻璃仪器均需以16.67%硝酸浸泡过夜，用水反复冲洗，最后用去离子水冲洗，以免污染试样。石墨炉原子吸收光谱分析法是一种灵敏度高、适合测定铅的测试技术，但是存在基体干扰严重等缺点，故在石墨炉原子吸收分光光度分析工作中，应注意背景和其他原因引起的对测定结果的干扰。如，仪器工作原子化条件可能影响仪器的灵敏度、稳定程度。试验中，选择塞曼效应为背景校正系统[7]。该研究表明，浓度0.5%硝酸镁和硝酸钯是一种良好的基体改进剂，因此在校准曲线和标本测试过程中，设置自动进样器同时加入改进剂，就可以满足测定需要，减少测试步骤，避免基体干扰测试结果。按提取工艺对采自于云南省巍山县的华山松（Pinus armandii Franch.）松塔进行处理，得到抗HIV活性部位铅含量没有超标。

参考文献

[1]刘武青， 李磊珂， 郑永唐， 等.中药复方凉茶提取物体外抗HIV活性研究[J].中药材， 2010， 33（9）：1433-1437.

[2] 张桢，张鹏， 刘光明， 等.华山松松塔中抗HIV活性部位多糖的含量测定[J]. 时珍国医国药， 2010， 21（10）：2435-2436.

[3] 刘光明，吕永俊，李好枝，等. 云南松松塔中抗HIV活性成分研究初报[J]. 大理学院学报，2009，8（2）：69.

[4] 郑万均.中国树木志[M].北京：中国林业出版社， 1983：148.

[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010版[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[6] NAGATA K， SAKAGAMI H， HARADA H， et al. Inhibition of influenza virus infection by pine cone antitumor substances [J]. Antiviral Res， 1990， 13（1）：11-21.

[7] FUKUCHI K， SAKAGAMI H， IKEDA M， et al. Inhibition of herpessimplex virus infection by pine cone antitumor substances [J]. Anticancer Res， 1989， 9（2）：313-317.

[8] OH-HARA T， SAKAGAMI H， KAWAZOE Y， et al. Antimicrobialspectrum of lignin-related pine cone extracts of Pinus parviflora Sieb. et Zucc [J]. In Vivo， 1990， 4（1）：7-12.

[9] 张桢， 李春艳， 刘光明， 等. 华山松松塔体外抗HIV活性的研究[J]. 时珍国医国药， 2014， 25（1）：25-26.

[10] 中华人民共和国对外经济贸易合作部. 药用植物及制剂进出口绿色行业标准[S].北京：中国标准出版社， 2001.

责任编辑 刘月娟 责任校对 李岩