香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

陈娇　孙长君　杨昭　王朝政　李奕星　李芬芳　袁德保　谭琳　仇厚援　陈文学　金志强

摘 要 笔者所在课题组从巴西香蕉中分离到1个PPO基因全长，并进行了原核表达，但结果未表达出目的蛋白。鉴于上述情况，笔者对香蕉PPO全蛋白进行转移肽分析，结果发现其N端含有转移肽，长度为47个氨基酸。切除转移肽并进行香蕉PPO成熟蛋白原核表达，SDS-PAGE电泳检测结果表明，在62 ku处有一条特异的蛋白条带，与预测大小相符；并且进行质谱分析，结果确定重组表达蛋白为香蕉PPO，初步说明转移肽对香蕉PPO体外表达的影响，为进一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐变生理和调控机制中的作用提供理论基础。

关键词 香蕉；多酚氧化酶；转移肽；成熟蛋白；原核表达

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

Prokaryotic Expression of Polyphenol Oxidase Mature

Protein from Banana（Musa acuminate）

CHEN Jiao1， SUN Changjun1*， YANG Zhao2， WANG Chaozheng1， LI Yixing1， LI Fenfang1，

YUAN Debao1**， TAN Lin1**， CHOU Houyuan2， CHEN Wenxue2， JIN Zhiqiang1

1 Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key

Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou， Hainan 570102， China

2 Institute of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract A full-length PPO gene was isolated from banana， and the prokaryotic expression of this full-length gene was not succeeded. A 47 amino acids length transit peptide in its N-terminus was predicted by further amino acid sequence analysis. Prokaryotic expression of mature PPO protein without the transit peptide was performed. SDS-PAGE electrophoresis results showed a 62 ku specific protein bands with the expected size， and mass spectrometry analysis results showed that the recombinant protein was banana PPO. The results indicated that the transfer peptide may affect banana PPO expression in vitro， and lay some theory foundation to study the functions of banana PPO and its role in banana browning physiology and regulatory mechanisms.

Key words Banana；Polyphenol oxidase；Transit peptide；Mature protein；Prokaryotic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.015

香蕉（Musa acuminate）是世界最重要的水果之一，同时在一些经济不发达的国家也作为一种重要粮食作物[1-2]。然而香蕉自身非常容易褐变，褐变不仅影响了香蕉的外观品质，而且破坏了香蕉的质地结构和风味物质，导致其营养价值成分降低，从而严重限制香蕉加工产业的发展。人研究结果表明，多酚氧化酶引起的酶促褐变是香蕉褐变的主要原因[3-4]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一类广泛存在于动植物、真菌及细菌中的含铜质体金属酶[5-6]。广义上PPO可分为3大类：儿茶酚氧化酶、漆酶和酪氨酸酶[7]。PPO在生物体内色素合成及酶促褐变过程中起关键的作用[5，8-9]。因此，对香蕉PPO及其基因的研究具有巨大的理论和应用价值[10]。

目前，对香蕉PPO的研究主要集中在酶学特性、分离纯化、活性抑制等方面，对香蕉PPO基因的研究仍非常有限，主要是关于香蕉PPO基因部分序列扩增及香蕉果皮褐变与PPO基因表达量关系的研究[11-15]，但体外表达香蕉PPO基因的研究至今未见报道。基因的体外表达对研究其所编码蛋白质的结构、功能及其实际应用都十分重要[16]。根据外源基因表达的宿主不同，可将表达系统大致分为2类：原核和真核表达系统。原核表达系统是最常用的表达系统，也是最经济实惠目前研究最清楚的表达系统。根据现有大量研究结果表明，大部分植物PPO定位于质体膜上，需要经翻译后加工才能获得酶活。首先，含有转移肽（导肽）的前体PPO在核基因的控制下，在细胞质中合成，然后转移肽引导前体PPO进入叶绿体，而在PPO被引导进入质体后导肽则被切除。最后，PPO再经过一定的折叠等翻译后加工，而成为获得活性的成熟PPO[17]。

为了进一步深入研究香蕉PPO的结构与功能，并明确其与香蕉果皮褐变的关系。本研究将对未能成功表达的香蕉PPO全蛋白进行转移肽分析、切除，然后再进行香蕉成熟PPO原核表达，以期能够成功获得香蕉PPO成熟蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉PPO基因全长由本实验室自主克隆获得且已在GenBank登录（登录号：KF900300.1），并且已构建香蕉PPO全蛋白原核表达载体pQE80L - MaPPO1（含转移肽）。载体质粒pQE80L、感受态细胞E. coli DH5α由中国热带农业科学院海口实验站保存。宿主菌 E. coli M15为暨南大学姚占娟博士惠赠。Taq DNA聚合酶、pMD19-T、KpnⅠ、HindⅢ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、DNA marker购自TaKaRa 公司；Blue Plus Protein Marker（DM101）购自北京全式金生物技术有限公司；Folin-酚试剂（SK5031）购自生工生物工程（上海）有限公司；亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺购自BBI公司；琼脂糖金属螯合介质购自国家生化工程技术研究中心；其它常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 香蕉PPO全蛋白转移肽位置的分析 利用CBS网站上的TargetP 1.1 Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/psort）和ChloroP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）在线预测香蕉PPO全蛋白导肽位点和导肽形式，分析并确定香蕉 PPO 转移肽的位置，为成熟蛋白原核表达载体的构建提供基础。

1.2.2 香蕉PPO成熟蛋白基因克隆及原核表达载体的构建 通过软件ChloroP 1.1 Server在线预测，确定转移肽的位置，并将切除转移肽后的蛋白命名为MaPPO533，对应的基因命名为MaPPO533。根据 MaPPO533基因全长cDNA序列及pQE80L载体多克隆位点分析，在上下游引物上引入KpnⅠ和 HindⅢ酶切位点（上游引物：5′- CGGggtaccCCGat

gactgcaaatgccaagctcgac-3′，下游引物：5′-CCCaagc

ttGGtcaatt tgggaaatcgat-3′，下划线为酶切位点）。以香蕉全蛋白pQE80L-MaPPO1质粒为模板进行PCR扩增。PCR产物电泳检测后回收，与pQE80L质粒分别进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物回收后按一定分子比进行连接转化，挑取阳性克隆子提取质粒并进行PCR、酶切及测序等验证。

1.2.3 融合蛋白的诱导表达 挑取鉴定正确的阳性克隆单菌落接种至同时含有氨苄（Amp，50 μg/mL）和卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的LB液体培养基中，37 ℃过夜震荡培养；再按1 ∶ 100的比例同样接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约为0.6时，加IPTG至终浓度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L时诱导6 h；离心并收集菌液，4 ℃，12 000×g离心1 min；弃上清液，将菌体用磷酸缓冲溶液洗涤后煮沸破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。以空的宿主菌和含表达载体的宿主菌为对照，培养和诱导条件同上。

1.2.4 包涵体含量分析 菌液离心，用磷酸缓冲溶液重悬收集的菌体，菌液保持在冰浴状态超声破碎20 min（超声5 s，停歇30 s，再超声5 s），超声破碎后，12 000 r/min离心3 min，SDS-PAGE电泳检测分析超声后全液、离心后上清液和沉淀中蛋白表达情况。

1.2.5 包涵体的变性与复性 将pQE 80L-MaPPO533进行大量诱导表达后，收集菌体，超声破碎、离心，收集沉淀，得到粗制包涵体。用2 mL变性Ⅰ溶液（50 mmol/L Tris-Cl pH7.5，5 mmol/L DTT，2%Tritonx-100，5 mmol/L NaCl）悬浮，12 000 r/min离心5 min，重复此操作一次，然后用2 mL变性Ⅱ[19.2 g尿素溶于40 mL Tris-Cl溶液（50 mmol/L、pH8.0）]溶液悬浮，4 ℃过夜变性。将悬浮液4 ℃ 5 000 r/min离心30 min，保留上清。将上清转入7 500 Da的透析袋中，置于0.05 mol/L磷酸缓冲溶液（pH6.5）溶液中，4 ℃透析12 h，每隔4 h换一次磷酸缓冲溶液。收集透析袋内的液体，4 ℃ 、5 000 r/min离心30 min，上清是复性的蛋白。

1.2.6 包涵体纯化 首先如1.2.5得到蛋白变性溶液后，取1 mL装入10 mL离心管；然后颠倒混匀树脂，用3 mL无菌水悬浮树脂，500 r/min离心5 min，弃上清，并重复此步骤2次；接着用6 mL的Native binding buffer平衡树脂，500 r/min离心5 min，弃上清，再加入3 mL Native binding buffer；取1 mL蛋白质变性溶液与树脂4 ℃混合2～3 h，500 r/min离心5 min，弃上清；用4 mL的Native wash buffer悬浮树脂，500 r/min离心5 min，弃上清，重复3次；最后用2 mL的Native Elution buffer（含250 mmol/L咪唑）悬浮树脂，4 ℃混合1～2 h，500 r/min离心5 min，收集上清。

1.2.7 表达产物的酶活性分析 参照Galeazzi等[18]的方法。

1.2.8 重组蛋白质质谱鉴定 从 SDS-PAGE 的凝胶上切下重组蛋白条带，送至南京农业大学进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。

2 结果与分析

2.1 香蕉PPO转移肽位置的确定

TargetP 1.1 Server在线预测蛋白N端导肽形式，结果显示导肽为cTP（叶绿体导肽）、mTP（线粒体导肽）、SP（信号肽）的可能分值分别为0.878、0.118和0.038（表1），说明香蕉PPO全蛋白导肽为cTP（叶绿体导肽）的可能性最大，即香蕉PPO存在于叶绿体的可能性最大。另外，利用ChloroP 1.1 Server软件对其叶绿体转移肽进行在线预测，结果见表2，香蕉PPO存在转移肽的可能性为0.549，大于0.5，因此认为香蕉PPO含有长度为47个氨基酸的转移肽。所以在香蕉PPO全蛋白（登录号：KF900300.1）的基础上，切除了其N端55个氨基酸，以第56个氨基酸即蛋氨酸作为香蕉PPO成熟蛋白的起始氨基酸。香蕉PPO成熟蛋白命名为MaPPO533，成熟蛋白对应的基因命名为MaPPO533。

2.2 MaPPO533基因克隆及原核表达载体的鉴定

以本实验室已构建的香蕉pQE80L-MaPPO1重组质粒为模板，进行MaPPO533基因扩增。PCR产物电泳检测结果显示，在1 600 bp左右有明显的粗带，与预期片段大小一致，说明成功克隆到MaPPO533基因（图1-A）。酶切后的MaPPO533与同样经双酶切的原核表达载体pQE80L进行连接转化，构建原核表达载体pQE80L-MaPPO533。对构建的pQE80L-MaPPO533质粒进行KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切，产物电泳结果呈现出清晰的2条带（图1-B），分别为pQE80L（4 800 bp）和MaPPO533（1 599 bp），测序结果也证实连接成功。

2.3 MaPPO533成熟蛋白的原核表达

对香蕉pQE80L-MaPPO533 M15进行蛋白表达。SDS-PAGE电泳结果显示pQE80L-MaPPO533在IPTG诱导后于约62 ku处有一条特异性带，与其重组质粒的目的蛋白理论分子量大小基本一致，而经IPTG诱导的pQE80L空载体则无该目的条带，说明香蕉pQE80L-MaPPO533在大肠杆菌中成功表达，并且随着IPTG浓度的增大，蛋白表达量逐渐增大，当IPTG浓度为0.6 mmol/L时，表达量达到最大值（图2）。

2.4 pQE80L-MaPPO533表达产物包涵体含量分析

pQE80L-MaPPO533宿主菌经培养、诱导表达、超声破碎、离心后，分别取全液、上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析（图3），目的蛋白主要在沉淀中，上清中看不到表达条带，说明表达产物主要以包涵体形式存在，这可能与pQE80L-MaPPO533表达量小及原核表达通常存在目的蛋白以包涵体的形式表达有关。

2.5 包涵体的变性、复性及酶活力分析

包涵体为不溶性蛋白，无酶活力，故对香蕉pQE80L-MaPPO533包涵体进行变性和复性，以获得可溶性的香蕉MaPPO533。本研究中香蕉pQE80L-MaPPO533包涵体经系列溶液洗涤、溶解和超滤复性后，SDS-PAGE电泳显示得到单一的目的条带，基本去除杂蛋白，但目的条带弱（图 4）。同时，以邻苯二酚为底物，检测目的蛋白超声破碎后全液的酶活力为4.07 U/mg，而复性蛋白的酶活力为23.61 U/mg，酶活力提高了5.8倍。

2.6 蛋白质测序验证

将目的条带进行激光辅助解析/飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测序（图5），并通过Mascot软件对质谱所得数据进行检索鉴定，结果如图6所示，最后确定重组表达蛋白为香蕉PPO。

3 讨论与结论

前人研究结果表明，转移肽几乎存在于所有植物的PPO中[19-20]。在植物细胞内转移肽具有运输PPO并定位放置PPO的功能，并在完成相关功能后被切除，从而形成成熟的PPO蛋白[19-20]。但在大肠杆菌中，真核基因的转移肽不能被大肠杆菌识别，从而不能形成正确的剪切和折叠，而且导肽位于蛋白翻译起始序列，这部分没有功能但是非常疏水，因此往往导致PPO全长基因在大肠杆菌中难以表达， 刘敬卫等的研究结果也表明N端的导肽序列对蛋白的正确折叠确有影响，切去导肽后可降低基因对大肠杆菌的毒害作用，有利于蛋白表达量的增加，并且目前已有对多酚氧化酶原核表达的报道，基本都将PPO基因的导肽切除，然后进行原核表达[21-23]。笔者之前对香蕉PPO全长基因诱导表达，就存在未表达的情况。但本研究对香蕉PPO全蛋白进行转移肽去除后，成功表达出了目的蛋白，说明可能也存在N端的导肽序列对蛋白的正确折叠产生影响，从而影响蛋白表达的可能。

MaPPO533蛋白表达时主要形成包涵体，上清中几乎没有可溶性蛋白。包涵体是细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒，是大肠杆菌异源表达时的常见现象[24]。包涵体蛋白虽然往往无生物活性，需要重新溶解和复性，但包涵体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，增加了产物的稳定性，同时包涵体中杂蛋白的含量少，这也为重组蛋白的分离与纯化带来了极大的方便，通过对包涵体的纯化，可得到纯度较高的目的蛋白[25-26]。为此，笔者们采取了对包涵体的变性复性研究，虽然电泳显示目的条带较弱，但酶活性测定结果表明，复性后酶活力是复性前的5.8倍。为了得到大量高活性的香蕉PPO重组蛋白，在今后的研究中可尝试将香蕉PPO进行真核表达。

综上所述，本实验通过生物工具在线分析对克隆得到的香蕉PPO全蛋白进行了转运肽分析，然后去除并成功实现了香蕉成熟PPO蛋白的原核表达，并通过质谱鉴定，结果确定重组表达蛋白为香蕉PPO。这将对从基因水平和蛋白水平研究香蕉多酚氧化酶在香蕉褐变生理和调控机制中的作用有一定的指导作用。

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