响应面分析法优化枇杷叶多酚提取工艺

王建超　王卿　施文昊　祁芳斌　陈发兴

摘 要 以枇杷叶为试材，在单因素试验基础上，采用响应面分析法，建立料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间等4个因素影响枇杷叶多酚提取率的二次多项回归模型，并验证该数学模型的有效预测性。结果表明：料液比、提取温度、提取时间是影响枇杷叶多酚提取率的主要因素；随着料液比和提取温度的增加，枇杷叶多酚提取率呈先上升后下降的趋势，二者交互作用差异具有统计学意义。试验检验了枇杷叶多酚的最佳提取条件为：料液比1 ∶ 21（g ∶ mL）、乙醇浓度48.5%、温度60 ℃、浸提时间2.6 h，获得提取率为3.40%，该值与理论预测值3.44%接近，证明该模型可较好的指导枇杷叶多酚的提取条件。

关键词 枇杷叶；多酚；提取率；响应面分析

中图分类号 O657.63 文献标识码 A

枇杷[Eriobotrya japonica（Thumb.）Lindl.]别名卢橘，为蔷薇科枇杷属植物，因叶形似琵琶得名。中国是枇杷的主产地，其产量约占全世界总产量的67%。枇杷叶、花、果实都有极高的药用价值，可谓“周身遍是宝”，并且其营养价值也很高[1]。常用作中药材的枇杷叶为枇杷的干燥叶，枇杷叶味苦，性微寒，归脾、肺经，具有清热止咳、降逆和胃的功效，特别是用于治疗肺热咳嗽、胃热呕逆等[2]。据报道，从枇杷叶中已分离得到的有效成分主要有挥发油、三萜酸类、多酚类、黄酮类、倍半萜类、有机酸类等化合物[3]。植物多酚具有很高的生物活性，拥有极强的抗氧化和抑菌能力[4]，目前对枇杷叶的研究主要集中在三萜酸类化合物，但对枇杷叶多酚的报道比较少，为了更深入的研究枇杷叶多酚的生理活性，本研究利用响应面分析法优化枇杷叶多酚的提取工艺，达到节省材料，提高利用率的目的，以期对枇杷叶多酚的开发利用提供理论指导。

响应面分析（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过分析回归方程来求得最佳工艺参数，以解决多变量问题的一种统计方法。与其它分析方法相比具有试验周期短，回归方程精确度高，能研究多因素间交互作用等优点[5]。本实验在单因素试验的基础上，选取料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间4个因素进行Box-Behnken Design（BBD）优化枇杷叶多酚的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于2013年12月在福建省莆田市白沙镇山地果园，土壤为山地黄壤、偏酸性的枇杷种植基地，选择生长一致、管理水平相同的早钟六号枇杷（8年生），随机采摘略带黄色的成熟老叶；经清水清洗，除去表面灰尘及杂物，然后置于50 ℃烘箱烘干（含水量低于1%），粉碎后过60目筛，所得的枇杷叶粉末贮存于-20 ℃低温冰箱保存备用。

1.1.2 试剂与仪器 主要试剂：没食子酸（色谱纯，国药集团化学试剂公司），福林酚试剂（国药集团化学试剂公司），无水乙醇（分析纯），无水碳酸钠（分析纯），水为蒸馏水。

主要仪器：日本日立UV-2009型双光束分光光度计；EL204型电子天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；101-0型电热鼓风干燥箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司；Eppendorf 5810R台式高速大容量离心机；DK-S24型数显恒温水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司；FW177型中草药粉碎机，购自天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取10 mg没食子酸标准品，定容于100 mL容量瓶制成0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别吸取100、200、300、400、500、600 μL标准溶液于10 mL容量瓶中，然后分别加入1 mL福林酚试剂和2 mL 15%的碳酸钠溶液，常温下避光反应2 h，在765 nm波长处测定样品的吸光值。以样品浓度为x轴，吸光值为y轴绘制没食子酸标准曲线（图1）。

通过线性分析得到回归方程，求的回归方程为：y=0.127 2 x+0.052 4，其中x为没食子酸浓度，单位为mg/L，y为吸光度，R2=0.998 8。

1.2.2 枇杷叶多酚的提取及含量测定 精密称取枇杷叶粉末，按照一定的料液比加入已知浓度的乙醇溶液中，置于一定温度的恒温水浴锅内加热提取，浸提结束后取上清液冷却，离心。将100 μL提取液定容至5 mL，避光静置1 min，准确吸取100 μL待测液，加入1 300 mL蒸馏水，混合均匀，然后加入200 μL福林酚试剂和400 μL碳酸钠溶液（质量分数为15%），避光充分反应2 h，于765 nm处测定吸光值，根据回归方程计算枇杷叶多酚质量。每个实验做3次重复，取平均值。枇杷叶多酚提取率按下列公式计算：

多酚提取率/%=×100

其中，y为吸光值；m为枇杷叶质量（g）。

1.2.3 单因素及其响应面优化试验设计 准确称取1.0 g枇杷叶粉末，在料液比、乙醇浓度（乙醇浓度为0%时的空白提取率为1.83%，远低于乙醇高浓度的提取率）、提取温度和提取时间等4个单因素条件下（表1），确定提取因素的变化范围及各因素的适应值。将每次提取上清液离心、定容、避光反应，检测提取液中枇杷叶多酚的含量，并折算为得率。

在此基础上，根据Box-Behnken的试验设计原理，每个自变量取3个水平（依据单因素试验结果），以-1、0、1进行编码，以枇杷叶多酚提取率为响应值。

1.3 统计分析

采用SPSS与Design Expert 8.0.6统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对枇杷叶多酚的影响

料液比为1 ∶ 10～1 ∶ 20时，随着料液比的提高枇杷叶多酚溶出的更加充分，提取率也明显增加（图2-A）；当料液比达1 ∶ 20后，由于多酚已基本溶出，对提取率增加不大，为了节省原料，选择1 ∶ 20为佳。

随着乙醇浓度的增加，枇杷叶多酚提取率增加（图2-B）。乙醇浓度的提高，加速了多酚与其他物质连接的氢键的断裂，促进了多酚溶解在乙醇溶液当中，提取率增大[6]。当乙醇浓度为50%时，多酚提取率最大；乙醇浓度超过50%时，随着浓度的提高枇杷叶提取率反而下降，其原因可能是：多酚与溶剂的极性差异变大，多酚类物质不能充分溶解，导致多酚提取率下降。由此确定乙醇的最佳浓度为50%。

在40～60 ℃时，随着温度的上升提取率明显增加（图2-C）。提取温度的升高加速了分子的运动，促进了枇杷叶多酚在乙醇溶液中的溶出。高于60 ℃时，随提取温度的升高，多酚提取率下降，由于温度过高反而破坏了多酚结构，水和乙醇挥发，杂质溶出增加，乙醇提取枇杷叶多酚的最佳温度为60 ℃。

料液接触时间越长越有利于枇杷叶多酚的溶出，当达到2.5 h时，提取率趋于稳定（图2-D），所以最佳浸提时间选择2.5 h。

2.2 枇杷叶多酚的响应面分析

根据单因素实验的结果，所选响应因子及水平见表2。

所有测定实验重复3次，以枇杷叶多酚提取率为响应值的响应面试验设计与结果见表3，得到枇杷叶多酚提取率（Y）对料液比（X1）、乙醇浓度（X2）、提取温度（X3）、提取时间（X4）的二次多项回归模型为：

Y=3.36+0.15X1+0.04X2+0.066X3+0.28X4-0.04X1X2+0.14X1X3+0.034X1X4+0.001X2X3-0.063X2X4-0.019X3X4-0.24X12-0.29X22-0.36X32-0.31X42（R2=0.981 7）

为了检验方程的有效性，对多酚提取的数学模型进行方差分析。由表4可知，枇杷叶多酚提取率为响应值时，该二次方程模型极显著（p<0.010 0）。回归方程失拟性检验无统计学意义（p=0.171 3），表明未知因素对试验结果干扰很小；回归方程的相关系数（R2=0.981 7，Adj-R2=0.963 5，Pred-R2=0.904 6）及变异系数CV（2.20%）均表明模型方程能够较好地反映真实的试验值。该方程与实际情况拟合很好，较好地反映了枇杷叶多酚提取率与料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间的关系，因此所得的回归方程能较好的预测多酚提取率随各参数的变化规律。实验所选4个因素中X1、X2、X3、X4和X1X3及二次项的影响差异显著，其中X1、X3、X4为极显著，说明料液比、提取温度、提取时间均对枇杷叶多酚提取率有极显著影响，乙醇浓度影响最弱，但也达到了有统计学意义水平（p<0.05），并且料液比和提取温度交互作用极明显。综合以上各参数表明该试验方法可靠，各因素水平间设计合理，因此可用该回归模型代替实验真实地对结果进行分析。

响应面图形是响应值对各试验因子X1、X2、X3、X4所构成的三维空间的曲面图（图3），从图3可以看出，最佳参数及各参数之间的相互作用。当响应面分析图为山谷形曲面，特征值均为正值，有极小值存在；当响应面分析图为山丘曲面时，特征值为负值，有极大值存在；当响应面分析图为马鞍形曲面时，特征值有正有负，无极值存在[7]。根据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等值线图，分析两两因素交互作用对提取效果的影响。通过Design Expert 8.0.6软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图。等高线图可直观反映出2个变量间交互作用的显著程度，其中圆形表示两两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两两因素交互作用显著[8]。料液比和提取温度之间表现为曲面较陡，交互作用显著（图3）；当料液比一定，提取温度小于60 ℃时，提取率随温度的升高而急剧增大；随着温度高于60 ℃时，提取率开始下降，变化明显。当温度一定时，料液比的变化会显著影响枇杷叶多酚的提取率。其他交互作用方差分析p值均大于0.05，表明对于枇杷叶多酚提取率的影响，交互作用不明显。

2.3 枇杷叶多酚提取最优工艺及其验证

料液比、提取温度和提取时间是影响枇杷叶多酚提取率的最主要因素，乙醇浓度次之，选择合适的提取条件，可获得较高的枇杷叶多酚提取率。通过对解决方案的分析，考虑到节省物料、时间与提取率最高等因素，对若干响应面结果进行最优分析验证，结果见表5。通过分析进行验证试验，得到枇杷叶多酚提取率的实际值，该值与理论预测值进行比较，计算相对误差。通过验证实验结果发现，提取工艺的最佳理论方案：料液比为1 ∶ 21.13，乙醇浓度为48.50%，提取温度为59.75 ℃，提取时间为2.61 h，理论预测提取率为3.44%。实验实际条件：料液比为1 ∶ 21，乙醇浓度为48.5%，温度为60 ℃，时间为2.6 h，得到枇杷叶多酚提取率的实际值为3.40%，提取率最高，且该值与理论预测值3.44的相对误差仅为1.18%，说明该模型具有好的分析能力，可为实际操作提供良好的指导。

3 讨论与结论

有机溶剂萃取、超声辅助浸提、超临界流体萃取及微波辅助浸提等常用于植物多酚的提取。但由于植物种类的不同或植物体的不同部位，在提取多酚类物质时，需考虑采用不同工艺或不同的工艺参数[9]。为了获取高提取率、高纯度、性能优良的多酚物质，采用响应面分析法优化提取工艺，以达到省时、高效、节能、环保的目的。Seiad等[10]应用响应面分析法研究结果表明，在45 ℃萃取温度条件下，哈列朋松（Pinus halepensis Mill）树皮多酚提取率最高。在石榴皮多酚提取的正交试验优化工艺中，乙醇浓度为20%，料液比为1 ∶ 20，可获得最佳多酚提取率为22.86%[11]；在石榴渣多酚时，乙醇浓度为50%，从中分离出多种多酚单体[12]。枇杷叶多酚萃取最佳提取工艺：料液比为1 ∶ 21，乙醇浓度为48.5%，温度为60 ℃，时间为2.6 h；通过与不同材料多酚提取进行比较，结果表明不同物种多酚萃取工艺参数差异较大，推测枇杷叶多酚的含量及其所含单体的极性差异，这方面尚需进一步纯化鉴定，与石榴多酚提取液浓度大致相同，推断枇杷叶多酚可能含有大量与石榴多酚类似单体。本试验运用响应面法对枇杷叶多酚提取进行优化，提高了枇杷叶多酚提取率。植物酚类物质属于路易斯酸，因含有酚羟基，具有极性。因此，在分离纯化植物多酚时，应考虑选择具有很强的选择性和高效性的萃取方法，如可逆络合反应的有机物萃取分离法[13]。为了更大的提高多酚提取率，先进的提取方法能大幅度提高提取效率，在以后的试验中将尝试更多的分析优化方法，从而提高提取效率，给予生产加工提供科学指导。

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