超高效液相色谱-串联质谱法测定烟用水基胶中邻苯二甲酸酯类化合物

阎 瑾，鲍峰伟，牛丽娜，刘 辉，苏国岁

(河北中烟工业有限责任公司 技术中心，河北 石家庄 050051)

超高效液相色谱-串联质谱法测定烟用水基胶中邻苯二甲酸酯类化合物

阎 瑾，鲍峰伟*，牛丽娜，刘 辉，苏国岁

(河北中烟工业有限责任公司 技术中心，河北 石家庄 050051)

建立了一种测定烟用水基胶中17种邻苯二甲酸酯类(PAEs)化合物的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法。样品经水分散，以甲醇定容，涡旋振荡萃取。萃取液离心后，过有机相滤膜进行UPLC-MS/MS分析。通过增加延时柱的方法，排除色谱系统带入的PAEs干扰。结果表明：在0～5 μg/mL范围内，方法的线性关系良好，相关系数均大于0.994，定量下限为0.010～0.479 μg/g。该方法的回收率为87.6%～106.0%，相对标准偏差(RSD,n=6)为0.8%～6.2%。将该方法与YC/T 333-2010标准方法进行对比，结果显示两种方法的检测数据不存在显著性差异。方法用于烟用水基胶中17种PAEs的测定，操作简单，稳定性好。

邻苯二甲酸酯；超高效液相色谱-串联质谱；烟用水基胶；延时柱

邻苯二甲酸酯(Phthalate acid esters,PAEs)是一类挥发性低、稳定性高且无味或具有芳香气味的物质，具有增强聚合物的可塑性、柔韧性和流动性等作用，被作为塑化剂广泛使用[1]。PAEs已被证明对人体和环境具有危害性[2-4]，并且易从聚合物中释放[5]，因此各国对此类物质的使用均有严格规范[6-8]。

烟用水基胶中PAEs的测定一般采用气相色谱-质谱联用[9]和液相色谱[10]法。烟草行业标准YC/T 333-2010[11]规定了7种PAEs的检测方法，但未能完全覆盖明确和疑似[12-14]对人体有危害的PAEs种类，因此参照相关法规及检测标准[11,15-21]，本文选取17种PAEs为待测化合物。由于气相色谱对于碳原子数较多的异构体化合物(如邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)等)分离效果较差，峰形重叠，定性定量难度大，因此，本文采用液相色谱-串联质谱法对样品进行检测。由于液相色谱流路多为聚四氟乙烯材质，工作中会带入多种PAEs干扰物，干扰定量，为解决该问题，在液相色谱高压泵和自动进样器六通阀之间增加一根延时柱，系统带入的PAEs经延时柱保留，滞后进入分析柱，通过延长保留时间排除干扰，从而降低了测试的不确定性，提高了数据的可靠性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1290超高效液相色谱(美国Agilent公司)，配有G4220A二元泵，G4226A自动进样器和G1316C柱温箱；Agilent 6430三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；AG285电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；基本型多管式旋涡混合器(美国Talboys公司)；LG16-WA型高速离心机(北京京立离心机有限公司)。

17种邻苯二甲酸酯类标准品：邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二环己酯(Dicyclohexyl phthalate,DCHP)、邻苯二甲酸二异丁酯(Diisobutyl phthalate,DIBP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(Bis(4-methyl-2-pentyl) phthalate,BMPP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基乙基)酯(Bis(2-ethoxyethyl) phthalate,DEEP)、邻苯二甲酸二苯酯(Diphenyl phthalate)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基乙基)酯(Bis(2-n-butoxyethyl) phthalate,DBEP)、邻苯二甲酸二异壬酯(Diisononyl phthalate,DINP)，纯度均为99%；邻苯二甲酸二戊酯(Dipentyl phthalate,DPP)、邻苯二甲酸丁基苄酯(Benzyl butyl phthalate,BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)、邻苯二甲酸二壬酯(Dinonyl phthalate,DNP)、邻苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DNOP)，纯度均为98%；邻苯二甲酸二己酯(Dihexyl phthalate,DHXP，97%)；邻苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(Bis(2-methoxyethyl) phthalate,DMEP，96%)，上述标准品均由美国Alfa Aesar提供。

甲醇、乙腈(美国J.K.Baker公司)，甲酸(美国Alfa Aesar公司)，乙醇(韩国Duksan公司)，异丙醇(美国Tedia公司)，以上试剂均为色谱纯，实验用水为去离子水。烟用水基胶样品由生产厂家提供。

为防止实验过程中外部环境对目标化合物检测的干扰，需对实验所用玻璃器皿进行预处理，玻璃器皿洗净后用一级水淋洗3次，经丙酮浸泡1 h，室温挥干后，置于200 ℃烘箱中2 h，实验过程中避免使用塑料制品[11]。

1.2 样品制备

准确称取0.30 g(精确至0.01 g)混合均匀的水基胶样品于10 mL容量瓶中，立即加入2 mL水分散样品，用甲醇定容至刻度后，全部转移至10 mL离心管中。涡旋振荡10 min，在10 000 r/min条件下离心5 min，取上层清液过0.45 μm有机相滤膜后进行UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm，Agilent);延时柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Agilent)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸甲醇溶液；柱温：50 ℃；进样量：2 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0.0～1.0 min，45% B；1.0～4.0 min，45%～65% B；4.0～8.0 min，65% B；8.0～15.0 min，65%～80% B；15.0～16.0 min，80%～90% B；16.0～20.0 min，90%～100% B；20.0～25.0 min，100% B；25.0～25.1 min，100%～45% B；25.1～30.0 min，45% B。

扫描模式：电喷雾正离子扫描ESI(+)；毛细管电压：4 000 V；干燥气：氮气；气流量：10 L/min；温度：350 ℃；雾化器压力：15 psi；碰撞气：高纯氮气；监测方式：多反应监测(MRM)。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶液的选择

为选择适宜的萃取溶液，分别考察了甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈4种溶剂对50 μg/g加标样品的萃取效果(以回收率为参考指标)。为保证所选溶剂具有充分的萃取能力，设定称样量为0.5 g，其余操作按“1.2”和“1.3”条件进行。

表1测试结果表明，4种溶剂对17种PAEs的整体回收率大小顺序依次为：甲醇>乙醇>乙腈>异丙醇。其中，异丙醇的回收率很低，可能与样品未能完全分散于异丙醇中、胶体结块有关；甲醇、乙醇、乙腈3种溶剂的回收率均大于82%，能够较为完全地萃取测试样品中的PAEs。结合萃取过程中样品的状态，认为溶剂对胶体的分散能力是影响回收率的主要因素，对PAEs的溶解能力属于次要因素。由于以甲醇为溶剂对样品具有较好的分散效果和较高的回收率，并且方法的流动相为甲醇，故选择甲醇为萃取溶剂。

表1 不同萃取溶液下PAEs的测定回收率

2.2 萃取方式及时间

烟用水基胶的主要成分是聚乙酸乙烯酯，易分散于水中，较难分散于有机溶剂。为确保样品被充分混匀，在加入萃取溶液前先加入2 mL水稀释胶液，并采用旋涡混合器进行萃取。分别在萃取0，5，10，15，20，30 min时检测样品的PAEs含量。结果表明，萃取5 min后，各化合物的测定值趋于稳定，为保证萃取完全，选择萃取时间为10 min。

图1 干扰排除效果图

2.3 系统干扰的排除

液相色谱流路多为聚四氟乙烯材质，工作中会带入多种PAEs干扰物，经空针实验发现，本文的液相色谱系统中，DIBP，DBP，DNOP的空白值很高，对测定结果存在较大干扰。为此，在高压泵和自动进样器六通阀之间接入一根延时色谱柱，以达到排除干扰的作用(图1)。其工作原理为：梯度洗脱模式下，有机相初始比例较低，洗脱能力较弱，因此在进样之前，色谱系统带入的PAEs被吸附在延时柱中，随着进样后流动相中有机相比例的逐渐提高，延时柱中保留的PAEs被依次洗脱进入分析柱，因此始终比样品中的PAEs延后流出分析柱，二者保留时间不同，从而达到排除干扰的目的。

2.4 质谱条件的选择

以质量浓度为100 μg/mL的邻苯二甲酸酯标准溶液进样，在正离子模式下进行全扫描，得到PAEs母离子，对母离子进行子离子扫描，得到子离子信息，选取丰度较强、干扰较小的两组离子作为定量和定性离子。为了达到更高的灵敏度，对解离电压、碰撞能量等参数进行优化，结果见表2。按上述优化条件对17种邻苯二甲酸酯标准品进样分析，得到MRM图(图2)。

表2 17种邻苯二甲酸酯类化合物的MRM参数和保留时间

*quantitative ion

图2 17种邻苯二甲酸酯标准溶液的MRM图

2.5 基质效应的考察

LC-MS/MS中的基质效应是由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用[22]。因此参照文献方法[23-24]，考察了基质效应对本实验的影响。

取水基胶样品，按0，5，10，20，50，100，150 μg/g的添加量加入混合标准溶液，按“1.2”与“1.3”方法进行处理分析，并绘制基质加标标准曲线。同时绘制同浓度范围的纯溶剂标准曲线。取同一水基胶样品(加标量40 μg/g)，按上述方法进行处理分析。

以上述两条曲线分别计算加标回收率，比较测定过程中的基质效应。实验结果表明，溶剂校准曲线计算所得PAEs 的平均回收率为87%～106%，基质加标校准曲线计算所得PAEs的回收率为89%～105%，二者无明显差异，因此本实验的基质效应对测定结果无明显影响。

2.6 线性范围、标准曲线、检出限及定量下限

取17种PAEs的混合标准溶液，用甲醇配制质量浓度分别为0，0.1，0.2，0.5，1，2，5 μg/mL的系列标准溶液，按“1.3”条件进行UPLC-MS/MS分析，以各PAEs的峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X，μg/mL)为横坐标作图，得线性方程及相关系数(见表3)。 结果表明，17种PAEs在0 ～5 μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.994。将0.1 μg/mL标准溶液重复进样10次，以3倍标准偏差(S/N=3)作为方法的检出限，10倍标准偏差(S/N=10)作为定量下限，17种PAEs的检出限为0.003～0.144 μg/g，定量下限为0.010～0.479 μg/g。

2.7 回收率与精密度

取同一水基胶样品，分别加入低、中、高(10，40，150 μg/g)3个水平的混合标准溶液，进行处理分析，各水平平行测定6次，计算回收率(见表3)。结果表明，17种PAEs的平均回收率为87.6%～106.0%，说明测定方法的结果比较准确，适用于烟用水基胶中PAEs的检测。

取同一水基胶样品6份，按20 μg/g的水平加入混合标准溶液，根据测定结果计算相对标准偏差(RSD)以表征测量精密度(见表3)。由表可见，各待测组分的相对标准偏差为0.8%～6.2%，表明本方法的重复性较好。

表3 17种邻苯二甲酸酯类化合物的线性方程、相关系数、检出限(LOD)、定量下限(LOQ)、回收率及相对标准偏差(RSD)

2.8 实际样品的检测及与标准方法的比较

选取10种烟用水基胶样品，分别采用本法和YC/T 333-2010[11]标准方法测定PAEs含量(表4)。除去未检出的DEP，BBP和DNOP，两种方法有4组可比数据。由于不同样品间PAEs的含量差异很大，对原始数据取自然对数后进行配对t检验。结果表明，PDMP=0.330，PDIBP=0.311，PDBP=0.493，PDEHP=0.770，4组可比数据的P值均大于0.05，表明两种方法的检测结果不存在显著性差异。图3为某一实际样品中各化合物的典型LC-MS/MS谱图。

表4 烟用水基胶样品中17种PAEs的含量

(续表4)

Compound1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#DBP3 513 254 653 493 664 082 293 742 932 16DBEP-0 010 010 010 010 010 020 040 010 01DPP0 020 030 020 020 040 020 05-0 020 02DCHP0 020 040 03-0 030 020 07-0 080 02BMPP6 025 375 786 256 166 296 575 808 216 58DHXP6 615 716 436 916 797 007 276 418 936 93DEHP5 803 5016 454 005 127 512 664 554 872 64DNOP----------DINP----------DNP----------DMP∗∗16 8512 2841 176 2523 3514 240 1620 479 700 06DEP∗∗----------DIBP∗∗16 2413 5633 776 9916 4314 810 9715 7111 610 94BBP∗∗----------DBP∗∗3 593 275 333 044 163 642 353 712 501 86DEHP∗∗5 993 4515 453 515 446 512 374 784 483 11DNOP∗∗----------

*no detected,**detection result of YC/T 333-2010 standard method

图3 实际样品的MRM图

3 结 论

本文建立了一种烟用水基胶中17种PAEs的UPLC-MS/MS分析方法。采用旋涡混合器萃取样品，使样品与萃取溶剂充分混合，确保PAEs能萃取完全，并通过增加延时柱，排除了色谱系统带入的PAEs对样品测定的干扰，降低了空白值，提高了测试的稳定性和可靠性。本方法在测试指标上较YC/T 333-2010具有更广的覆盖范围，且两种方法的检测数据不存在显著性差异，操作简单，稳定性好，定量下限为0.010～0.479 μg/g，回收率为87.6%～106.0%。

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Determination of Phthalate Acid Esters in Water-borne Adhesives for Cigarette by UPLC-MS/MS

YAN Jin,BAO Feng-wei*,NIU Li-na,LIU Hui,SU Guo-sui

(Technology Center,China Tobacco Hebei Industrial Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050051,China)

A method for the determination of 17 phthalate acid esters(PAEs) in water-borne adhesives for cigarette by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was developed.The samples were dispersed with water and dissolved with methanol at constant volume,then extracted with a vortex mixer vigorously and centrifuged.After passed through an organic phase filter membrane,the extract was analyzed by UPLC-MS/MS.The interference of PAEs that chromatography system introduced was removed with a delay column.The results showed that,the calibration curves of 17 PAEs showed good linearities in the range of 0-5 μg/mL,with correlation coefficients greater than 0.994.The limits of quantitation were in the range of 0.010-0.479 μg/g.The recoveries ranged form 87.6% to 106.0% with relative standard deviations(RSDs,n=6) of 0.8%-6.2%.Compared with YC/T 333-2010 standard method,there was no significant difference between the data obtained by two methods.With the advantages of simplicity and stability,this method was used for the determination of 17 PAEs in water-borne adhesives.

phthalate acid esters;UPLC-MS/MS;water-borne adhesives for cigarette;delay column

2014-09-11;

2014-09-30

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.002

O657.63；TQ414.1

A

1004-4957(2015)02-0134-07

*通讯作者：鲍峰伟，硕士，工程师，研究方向：烟草化学分析，Tel：0311-66006953，E-mail：bfwmail@yeah.net