毛茛总苷中扩血管活性物质实验研究

陈新建，刘守钾，杨智承，谭毓治

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)



毛茛总苷中扩血管活性物质实验研究

陈新建，刘守钾，杨智承，谭毓治*

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)

目的：探讨毛茛总苷中总黄酮含量与其扩血管作用关系。方法：采用大鼠离体胸主动脉环张力测定方法，观察毛茛总苷制备过程中不同浓度乙醇洗脱部位对去甲肾上腺素诱导的胸主动脉环收缩的抑制作用；以芦丁为标准品，采用紫外分光光度法测定对应各部位的总黄酮含量；以总黄酮终浓度为横坐标，以各不同部位对抗去甲肾上腺素引起的血管环收缩的抑制率为纵坐标，进行线性回归，分析二者相关性。结果：毛茛总苷不同部位对去甲肾上腺素诱导的主动脉环张力升高均有不同程度的抑制作用(P<0.05)；以总黄酮终浓度对毛茛总苷抑制去甲肾上腺素引起血管环收缩的抑制率进行线性回归，相关系数R2=0.919 9，相关性良好。结论：毛茛总苷中总黄酮类成分可能是引起血管扩张的活性成分。

毛茛总苷；舒张血管；胸主动脉环；总黄酮; 实验研究

毛茛(RanunculusjaponicusThunb)为毛茛科毛茛属多年生草本植物[1]。毛茛总苷是从毛茛中提取出来的苷类成分群。采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC/Q-TOF-MS)对毛茛总苷化学成分进行分析,并对主要成分进行鉴定，结果表明，其中内酯苷与黄酮苷为毛茛总苷的主要成分[2-3]。药理学研究表明，毛茛总苷具有舒张动脉血管和降低血压[4-5]、改善大鼠血流动力学[6]、抗心肌缺血[7]等作用。然而，毛茛总苷中扩血管的活性物质尚不明确，本文为此做了一些初步探讨。实验的基本思路是：采用大鼠离体胸主动脉环对毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位的扩血管作用进行测定，并以不同部位总黄酮剂量为横坐标，扩血管药理活性为纵坐标，对二者进行相关性分析，探讨毛茛总苷中扩血管的有效组分(物质基础)。

1 实验材料

1.1 试剂

毛茛总苷制备：毛茛药材采自江西省九江县，由广东药学院刘基柱副教授鉴定为毛茛科植物毛茛。毛茛全草，晒干，切碎，用75%(φ)乙醇回流提取3次，过80目筛，合并滤液，将浓缩得到的浸膏悬经大孔树脂D101树脂柱，分别用水洗(弃去)、乙醇洗脱，水浴蒸干乙醇得膏状物即毛茛总苷。

供试品制备：取毛茛总苷适量→D101大孔树脂柱→水洗脱至无色→分别用20%、30%、40%、50%乙醇梯度洗脱→洗脱液分别浓缩、烘干→分别称为20%乙醇洗脱部位、30%乙醇洗脱部位、40%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位，供实验用。

试剂：重酒石酸去甲肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，批号20100221，以下简称NE)；硝苯地平(上海华氏制药有限公司天平制药厂，批号96090502，以下简称Nif)；芦丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号100080-200707)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号: T20070418)。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

生物信号采集系统Medlab-U/4C501型)(南京美易科技公司)、HW-1000超级恒温器(成都泰盟科技有限公司)、UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)、AUW220D电子分析天平(日本岛津公司)。

1.3 动物

SPF级SD成年大鼠，体重280～320g，雌雄兼用，40只，购自广东省医学实验动物中心。生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002，粤监证字粤监证字2008A020。

2 实验方法与结果

2.1 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位总黄酮含量测定

按刘苑等[8]采用的紫外分光光度法测定每个供试样品中总黄酮的含量。以芦丁为对照品对照计算其含量。

2.2 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位对大鼠离体胸主动脉环的影响

2.2.1 胸主动脉环制备 取SD成年大鼠，处死后迅速分离出胸主动脉，置于4℃预冷的Kreb’s液(NaCl 6.9g，KCl 0.35g，MgSO4·7H2O 0.29g，KH2PO40.16g，NaHCO32.1g，CaCl20.28g，葡萄糖2.0g定容到1 000mL)中。剔除血管壁周围脂肪和结缔组织，清除管腔内残留积血，剪成4个等长血管环。按本实验室前期研究方法，将修剪干净的血管环两端固定，用与血管内径相适应的自制棉球刮除其内膜，连续数次。血管环水平悬挂于装有10mL Kreb’s液的37℃恒温浴槽中，持续通入含体积分数95% O2和5% CO2的混合气体，静息负荷1.2g，每15min换液1次，平衡稳定1.5h后给药。(给药前，可检验内皮是否去除完全，加入去甲肾上腺素(NE)1μmol/L，使血管环收缩，到达平台相后加入乙酰胆碱10μmol/L，舒张幅度不超过收缩幅度的10%时，说明去内皮完全。否则，弃之不用)[4]。以NE(106moL/L)诱发最大收缩幅度后分别加不同乙醇洗脱部位的药物。

2.2.2 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位对NE引起主动脉环收缩的影响 主动脉环在Kreb’s液中平衡1.5h，加入106mol/L NE，待主动脉环收缩达到坪值后再分别加入生理盐水，毛茛总苷20%、30%、40%、50%乙醇洗脱部位(1mg/mL、2mg/mL)和硝苯地平(1μg/mL)，药物浓度以浴槽中的终浓度表示。用预热的Kreb’s液调整各液面相平。采用MedLab生物信号采集系统记录张力变化。并按此公式计算药物的抑制率：药物抑制率(%) =[(F2-F3)/(F2- F1)]×100%。式中F1表示加NE前平衡的基础平均张力；F2表示加106mol/L NE后张力达坪时胸主动脉环的平均张力；F3表示加入药物后的平均张力。

2.3 毛茛总苷扩血管活性部位分析

以供试品总黄酮含量为横坐标，供试品对NE收缩血管的抑制率为纵坐标，以供试品中总黄酮含量对其药理效应(抑制由去甲肾上腺素引起的血管环收缩作用，用抑制率表示)进行线性回归。

2.4 统计分析

2.5 结果

2.5.1 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位中总黄酮含量测定 不同浓度乙醇洗脱部位供试品总黄酮含量测定结果为：20%、30%、40%、50%乙醇洗脱部位中总黄酮百分含量(w/w，%)分别为7.47%、20.28%、31.94%、29.82%。

2.5.2 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位对NE引起主动脉环收缩的影响 毛茛总苷中不同浓度乙醇洗脱部位对NE引起主动脉环收缩，均有不同程度的抑制作用，结果见图1及表1。表中A、B分别为1mg/mL、2mg/mL 20%醇部位的毛茛总苷处理组；C、D分别为1mg/mL、2mg/mL 30%醇部位的毛茛总苷处理组；E、F分别为1mg/mL、2mg/mL 40%醇部位的毛茛总苷处理组；G、H分别为1mg/mL、2mg/mL 50%醇部位的毛茛总苷处理组；I为1μg/mL Nif处理组；J为生理盐水组。与J组比较，毛茛总苷不同乙醇洗脱部位、硝苯地平组对去甲肾上腺素引起的主动脉环收缩均有不同程度的抑制作用(P<0.01)，抑制率从大到小排列为：F>E>H>I>G>D>C>B>A。

2.5.3 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位中总黄酮含量与扩血管作用相关分析 以表1中总黄酮终浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，将A～H各组数据作图并作直线回归，结果见图2。从图2可看出，A、B、C、D、G、H各点线性关系较明显，提示总黄酮含量与扩血管作用相关；而E、F两点明显偏离回归直线，抑制作用较其他点强，E、F为40%乙醇洗脱部位的低、高剂量。此现象提示，毛茛总苷中扩血管作用的物质除黄酮类成分外，可能还有其他成分，且这类成分可能主要在40%乙醇洗脱部位。

组别总黄酮终浓度(mg/L)F1F2F3抑制率(%)A74.71.244±0.0132.087±0.0201.768±0.04537.9±3.28**B149.41.254±0.0182.040±0.0301.705±0.03142.6±0.78**C2031.248±0.0362.422±0.0541.633±0.02069.0±1.87**D4061.269±0.0152.202±0.0391.415±0.01985.4±1.42**E3191.204±0.0032.218±0.0550.869±0.016133.1±2.99**F6381.266±0.0252.137±0.0140.694±0.026165.7±0.71**G2981.231±0.0222.075±0.0251.350±0.07785.9±6.47**H5961.214±0.0252.277±0.0281.045±0.055115.9±2.87**I1mg/LNif1.275±0.0322.101±0.0091.207±0.028108.2±0.71**J-1.239±0.0222.083±0.0542.091±0.013-(1.1±4.90)

注：与生理盐水组比较，**P<0.01。

图1 毛茛总苷不同浓度乙醇洗脱部位对NE引起大鼠主动脉环收缩的影响

图2的回归直线，相关系数R2=0.744 105，回归方程为Y=0.188 51X+28.689 99，相关性并不理想。删除E、F两点后，其他六点重新作直线，结果见图3。图3的线性相关系数R2=0.919 9，回归方程为Y=0.148 465X+30.047 56。表明相关性良好。

3 讨论

本研究通过制备离体小鼠胸主动脉环来研究毛茛总苷中不同浓度乙醇洗脱部位对去甲肾上腺素引起的主动脉环收缩的抑制作用，继而测定各不同部位黄酮类成分的含量，最后分析总黄酮含量与抑制率之间的线性关系，确定总黄酮与药效之间的相关关系。研究结果表明，毛茛总苷中总黄酮类可能是对抗去甲肾上腺素引起的主动脉环收缩的主要成分，并提示在40%乙醇洗脱的TGRJ部位中可能还含有其他类似作用的非黄酮类活性成分，具体为何物，仍需进一步研究。

图2 A～H各点总黄酮浓度对抑制率作直线回归

图3 A、B、C、D、G、H各点总黄酮浓度对抑制率作直线回归

本研究将化学成分与药理效应及数学分析三者结合，在不进行分离纯化的情况下，研究其活性成分或部位与药效学之间的关系，在中草药活性物质研究方面，有良好的参考价值和应用价值。

黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛存在于自然植物中,以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化，抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫力等药理作用[9]。有研究表明，黄酮类化合物具有扩张血管的作用，主要表现在可以改善心肌平滑肌的收缩舒张功能，其作用机制与黄酮类化合物调节平滑肌细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+释放有关。甲基黄酮醇胺盐酸盐的研究也表明其有抗实验性心律失常、实验性心肌梗塞和实验性血栓形成的作用，可以抑制钾钙引起的兔主动脉条及平滑肌收缩[10]。本实验研究表明，毛茛总苷中扩张血管的活性物质可能是黄酮类物质，为黄酮类物质扩血管作用提供了新的实验依据。

[1] 叶华谷, 彭少麟.广东植物多样性编目[M]. 广州：世界图书出版公司，2006: 81-82.

[2] 芮雯,冯毅凡,刘守钾, 等. 毛茛黄酮类成分的UPLC HILIC/Q-TOF-MS分析[J]. 亚太传统医药, 2011,7(8):18-21.

[3] RUI WEN, CHEN HONGYUAN, TAN YUZHI, et al. Rapid analysis of the main components in the total glycosides ofRanunculusjaponicusby UPLC/Q-TOF-MS[J]. Nat Prod Commun, 2010, 5(5): 783-788.

[4] 赵晋. 毛茛总苷心血管药理作用研究[D]. 广州：广东药学院，2008.

[5] 刘守钾, 刘苑, 张兴, 等. 毛茛总苷对肾性高血压大鼠血压、NO、AngⅡ及A7r5细胞内钙的影响[J]. 中药材, 2012, 35(6): 953-957.

[6] 杨智承, 刘守钾, 刘苑, 等. 毛茛总苷对麻醉大鼠血流动力学的影响[J]. 中药药理与临床, 2011, 27(2): 82-84.

[7] 张兴，刘苑，谭毓治, 等. 毛茛总苷对垂体后叶素所致实验性心肌缺血的影响，广东药学院学报, 2013, 29(2): 167-171.

[8] 刘苑, 张兴, 谭毓治, 等. 紫外分光光度法测定毛茛总苷不同部位总黄酮的含量[J]. 广东药学院学报, 2012, 28(2): 160-162.

[9] 曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23(12)：2241-2247.

[10] HUA H，GUO Y. Development in pharmacological research of flavonoids[J ]. Guangdong Pharmaceutical Journal，1999，9(4)：10-14.

(责任编辑：宋勇刚)

Experimental Study on the Active Substance of Expanding Vessel From Total Glycosides ofRanunculusJaponiucus

Chen Xinjian, Liu Shoujia, Yang Zhicheng, Tan Yuzhi*

(Guangdong Pharmaceutical University of Pharmacy College, Guangzhou 510006,China)

Objective:To study the relation between the total flavonoid content from the total glycosides of ranunculus japoniucus and its function of expanding vessel.Methods:Observed the inhibition effect of different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus on contraction of thoracic aortic induced by norepinephrine (NE) with the method of determining the tension of the thoracic aortic rings in vitro on the test rats .Measured the total flavonoid content in different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus by UV spectrophotometry ,and the Rutin was used to be the standard. Created the regression curve by using the total flavonoid contents as the abscissa and the inhibition rates of the different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus against the vessel loop as the vertical coordinate,and investigated the correlation regression between the above two by Logistic and linear statistics.Results:The different alcohol part of total glycosides of ranunculus japoniucus can restrain the increaseing of the thoracic aortic tension on different degrees which induced by norepinephrine (P<0.05). Investigated the correlation regression between the total flavonoid content and the inhibition rates of total glycosides of ranunculus japoniucus restraining the contraction of the vessel loop induced by norepinephrine (NE),and the correlation coefficient is 0.919 9,which shows a good correlation.Conclusion:The flavonoid in total glycosides of ranunculus japoniucus glycosides might be the active components that result in the vasodilatation.

The Total Glycosides ofRanunculusjaponiucusThunb; Vasodilatation Reconstruction of Cardiovascular ; Thoracic Aortic Ring ; Total Flavonoid; Experimental Study

2014-09-19

国家自然科学基金项目(81073141)

陈新建(1988-)，男，广东药学院硕士研究生，研究方向为新药筛选及作用机制。

谭毓治(1956-)，男，广东药学院教授，硕士生导师，研究方向为新药筛选及作用机制。

R285.5

A

1673-2197(2015)03-0011-03

10.11954/ytctyy.201503005