补骨脂二氢黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松症影响的实验研究＊

朱振标 沈 慧 林之斌 丁晓莉 刘亦恒

海口市人民医院骨科中心（海口570208）

骨质疏松（OP）是一种常见的老年性疾病，近几年来随着我国人口的老龄化，OP的发病率逐年上升，近年来，科学家们开始关注一组在人体内具有雌激素样作用的化合物，这些化合物主要包括金雀异黄素、补骨脂二氢黄酮、丹参酮、补骨脂二氢黄酮等。这一类化合物的化学结构与雌激素非常相似，其可发挥拟雌激素或抗激素效应。补骨脂二氢黄酮是补骨脂中的主要有效成分，其具有类似于植物雌激素的作用，而且毒副作用低微，因此可作为雌激素的替代品长期服用，避免了雌激素的致癌作用，值得深入的研究探讨。为了研究补骨脂二氢黄酮防治OP的作用机制，本次实验观察了补骨脂二氢黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响，探讨补骨脂二氢黄酮防治OP的作用机制。

1 实验材料 1.1实验动物 选用3月龄清洁级、雌性SD大鼠，共60只，体重为180±20g，购自长沙市天勤生物技术有限公司［许可证号：SCXK（湘）2009－0012］。

1.2 主要实验药物及试剂 补骨脂二氢黄酮粉（有效成分含量为40%）；免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）；γ－氨基丁酸B1型受体（GABABRI）多克隆抗体（英国Abcam公司生产）；γ－氨基丁酸（GABA）多克隆抗体（武汉博士德生物有限公司生产）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物公司生产）。

1.3 主要实验仪器及设备 双能X线骨密度仪（美国Lunar公司，Prodigy型）；电子天平（ACS－3C型，广州中山市新和基科技开发有限公司生产）；高速冷冻离心机（2－16K，德国Sigma公司）；显微镜（日本OLYMPUS公司）；凝胶成像系统（美国BIO－RAD公司，GELEQ）。

2 实验方法 2.1 实验分组 大鼠分笼饲养，自由摄取标准饲料，饮用自来水，适应性饲养1周后按随机数字表法将60只大鼠随机分为假手术组20只、手术组40只。假手术组大鼠行腹腔手术找到卵巢，但不切除，手术组大鼠行双侧卵巢切除术。12周后检测股骨骨密度及尿钙值，以确定OP动物模型是否复制成功，若成功后即将40只手术组大鼠再随机分为模型组20只、补骨脂二氢黄酮给药组20只。

2.2 制作OP模型 OP模型制做参照文献中的方法［1］，切除双侧卵巢制作大鼠OP模型。

将称重后的各组大鼠腹腔按40m／kg的剂量注射2%戊巴比妥钠，行全身麻醉后取仰卧位，固定后腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白线作纵行切口（切口长度约2～3cm），打开腹腔后切除大鼠双侧卵巢，术后切口用75%酒精棉球消毒。假手术组亦打开腹腔，但并不切除卵巢。术后为预防感染各组大鼠均腹腔注射10万单位青霉素（3mL／只），1d1次，连续3d。

2.3 给药方法 模型复制成功后，给药组大鼠用补骨脂二氢黄酮灌胃（50mg／kg·d）。将药物稀释成1.0mL／100g体重（5mg／mL）后即进行灌胃，灌胃前12h应禁食不禁水1d1次，持续12周。同时假手术组和模型组用等量生理盐水灌胃，同样持续12周。

2.4 股骨骨密度及尿钙测定 分别于手术后第12周及灌胃后12周，对各组大鼠行全身麻醉后采用双能X线骨密度仪测定股骨骨密度。收集各组大鼠尿液，测定24h尿钙排泄量。

2.5 标本采集 灌胃12周后处死大鼠，腹腔内注射40mg／kg 2%戊巴比妥钠，再依次灌注生理盐水（200～250mL）、4%多聚甲醛（350～400mL）。灌注完后即取左侧股骨，用DEPC水处理后，密封包裹保存于液氮中；取出右侧股骨用4%多聚甲醛固定24h（4℃条件下）。

2.6 免疫组化法检测GABA、GABABRI 按试剂盒说明书进行操作，应用Image－ProPlus6.0医学图像分析软件对表达结果进行半定量分析，测量免疫阳性部位的平均光密度。

2.7 统计学方法 用SPSS13.0软件进行统计分析，结果采用均数士标准差（±s）表示。组间比较用单因素方差分析（one－wayANOVA）（方差齐时采用Tukey检验，方差不齐时采用 Dulmett＇sT3检验）。

3 结 果 3.1 一般情况 给药一段时间后，发现模型组大鼠反应迟缓，懒动，体态变得臃肿，皮毛发黄且欠光泽，而假手术组和补骨脂二氢黄酮给药组大鼠则身形敏捷，反应灵敏，皮毛光滑有光泽。灌胃结束后可能由于麻醉、灌胃等原因，一部分大鼠出现死亡，假手术组大鼠死亡1只，模型组死亡3只，补骨脂二氢黄酮给药组死亡2只。

3.2 手术12周后测定各组大鼠股骨骨密度与尿钙值手术12周后，与假手术组比较，手术组大鼠股骨骨密度值下降（P＜0.05）；尿钙值明显升高（P＜0.01），这说明手术组大鼠的骨量明显丢失，尿钙大量排泄，同时提示OP模型复制成功。见表1。

表1 手术12周后各组大鼠股骨骨密度、尿钙结果比较（±s）

表1 手术12周后各组大鼠股骨骨密度、尿钙结果比较（±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01

组 别 n 股骨骨密度（mg／cm2） 尿钙（mmol／L）手术组 40 120.8±5.2△ 5.1±1.7▲20 131.6±4.4 2.8±0.5假手术组

3.3 灌胃12周后测定各组大鼠股骨骨密度与尿钙结果灌胃12周后，与模型组比较，补骨脂二氢黄酮组大鼠股骨骨密度值升高（P＜0.05）；尿钙排泄明显减少（P＜0.01）。见表2。

表2 灌胃12周后各组大鼠股骨骨密度、尿钙结果比较（±s）

表2 灌胃12周后各组大鼠股骨骨密度、尿钙结果比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01

17 120.8±5.2 5.1±1.7假手术组 19 131.6±4.4△ 2.8±0.5▲补骨脂二氢黄酮给药组18 128.9±4.2△ 2.9±0.6模型组▲

3.4 各组大鼠股骨组织GABA含量 见表3。

表3 各组大鼠骨组织GABA含量（±s）

表3 各组大鼠骨组织GABA含量（±s）

注：与模型组比较△P＜0.05

17 10mL 0.0306±0.0103假手术组 19 10mL 0.0182±0.0059△补骨脂二氢黄酮给药组 18 50mg 0.0201±0.0131平均光密度模型组组别 n 剂量（／kg·d）△

3.5 各组大鼠骨组织GABABRI含量 见表4。

表4 各组大鼠骨组织GABABRI表达（±s）

表4 各组大鼠骨组织GABABRI表达（±s）

注：与模型组比较△P＜0.05

17 10mL 0.0169±0.0090假手术组 19 10mL 0.0109±0.0051△补骨脂二氢黄酮给药组 18 50mg 0.0112±0.0058平均光密度模型组组别 n 剂量（／kg·d）△

4 讨 论 OP是一种常见的老年性疾病，近年来，学者们对其研究较多［2－4］，目前研究认为GABA是哺乳动物神经系统中最重要的抑制性神经递质，以GABA为递质的中枢突触部位约占50%，GABA在生物体内具有重要的生理功能，参与多种神经生理活动，己报道其具有调节血压、促进脑部血流、营养神经细胞、预防肥胖、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等生理活性［5］。祖国医学将骨质疏松称为骨痿、骨痹，其病因归类如下：①先天禀赋不足：由于父母体虚导致先天遗传不足，孕育不足以致肾气亏虚，肾精不足，髓空骨软而发为本病；②饮食不节：脾为后天之本、气血生化之源，若暴饮暴食、嗜欲偏食、饮酒过度等原因均可损伤脾胃，若脾胃长期受损，导致脾主运化水谷精微的功能出现异常则可致机体脏腑、四肢百骸失于滋养，肌肉瘦削而发为本病；③久病失治：大病之后，脏气损伤，失于调理，正气亏虚难复，精气亏耗，伤及五脏，最终必伤及肾而发为本病。补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL的干燥成熟果实，又名怀故子、川故子、黑故纸、破故纸，具有温肾助阳，纳气，止泻的功效。药理实验研究表明其具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、抗肿瘤、抗菌、双向调节平滑肌以及雌激素样作用，临床广泛用于治疗肾虚腰膝痛、骨痿、骨痹，具有促进成骨细胞的增殖与分化，抗骨质疏松的作用［6］。

从本次研究中发现，与假手术组比较，模型组大鼠股骨骨密度降低，尿钙值升高，骨组织中GABA和GABABRI的含量增多。但当用补骨脂二氢黄酮灌胃12周后发现给药组大鼠股骨骨密度值升高，尿钙值降低，骨组织GABA和GABABRI的含量明显减少，但与假手术组比较无显著性差异，说明补骨脂二氢黄酮可以增加OP模型大鼠的骨密度，降低了成骨的迫切性，使神经系统的调节作用减缓，减少了GABA及相关物质的释放。推测当GABA在身体内大量聚集但又不能及时被转运的情况下，GABA可能是通过GABABR抑制OB的活性，OP模型大鼠经补骨脂二氢黄酮灌胃治疗后股骨骨密度增加，尿钙减少，骨组织中GABA、GABABRI含量均下降，这说明补骨脂二氢黄酮可能是通过GABA抑制OB活性这种途径防治OP，这可能是补骨脂二氢黄酮治疗OP的机制之一。

［1］ 谢义松，张紫铭，吴官保.等.虎潜丸对去印巢大鼠骨质疏松模型骨密度及转化生长因子β1表达的影响［J］.中医正骨，2013，25（12）：11－14.

［2］ 李连弟，郭大江.补中益气汤加味治疗老年性骨质疏松症疗效观察［J］.陕西中医，2013，33（12）：1625－1627.

［3］ 马 伟，马占洋，王福山，等.延经丸对去卵巢骨质疏松大鼠血清PTH、CT的影响［J］.陕西中医，2012，33（12）：625－626.

［4］ 韩丽萍，魏敏惠，王相东，等.补肾活血方及其拆方对骨质疏松大鼠骨密度及组织形态的影响［J］.陕西中医，2013，36（2）：85－87.

［5］ 刘志广.腺苷A1受体在癫痫发病机制中的作用及其与GABA信号通路相关性的研究［D］.华中科技大学，2013，5.

［6］ 李 璘，邱蓉丽，乐 巍，等.补骨脂雌激素样作用实验研究［J］.辽宁中医药大学学报，2012，14（4）：57－59.