ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉的毒性与营养分析

刘 宗，宋 莉，2* ，赵德刚，2*

(1.贵州大学农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，生命科学学院，贵州 贵阳 550025;2.山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州 贵阳 550025)

鸡 γ －干扰素(Chicken interferon gamma，ChIFN－γ)具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、增强疫苗免疫及抗球虫等作用［1］。γ－干扰素(interferon gamma，IFN－γ)通过促进NK细胞的杀伤活性［2］，以及诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力等途径实现其生物学功能［3］。酵母营养丰富，蛋白质和必需氨基酸含量高，广泛应用于畜牧业中5，6］。利用酵母菌作为宿主表达生产干扰素具有培养控制容易，生长繁殖迅速，生产成本低廉，安全性高，表达产物具有活性和稳定性［4］等优势。饲用酵母污染化学物质和致病微生物后，会导致品质变劣和畜禽中毒甚至死亡［7，8］。饲料霉菌污染每年给全球造成的经济损失可达数千亿美金［9］。感官性状以及重金属和微生物等卫生学指标，可以有效反映饲料酵母的质量，关系到饲料安全、动物养殖、食品安全和人类健康。本研究对实验室前期获得的ChIFN－γ酿酒酵母工程菌进行干粉制备并对其安全性及营养价值进行评价分析，为进一步开发利用ChIFN－γ微生态饲料添加剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型酿酒酵母菌株INVSC1购自Invitrogen公司，携带ChIFN－γ基因的INVSC1/pYE－IFNG重组酵母工程菌株由本实验室创制。

1.2 方法

1.2.1 酵母工程菌粉制备 INVSC1/pYE－IFNG酿酒酵母工程菌的培养和目标蛋白诱导表达操作参见相关文献［10］。诱导表达后的工程菌液按1500×g、4℃离心5 min，细胞沉淀用500μL灭菌水重悬后再用10000 r/min离心30 s，得到的细胞按建立的低温冷冻干燥体系(另文发表)加入保护剂进行重组工程菌干粉制备。

1.2.2 菌种形态鉴别 将重组工程菌干粉进行复性和活化，接种到麦芽汁液体培养基和麦芽汁固体培养基中，28℃培养3 d后，观察其生长情况和显微形态。

1.2.3 感官指标分析 取100 g样品置于干净白色纸片上，观察其色泽、形态、有无杂质和异味。

1.2.4 酵母活细胞数测定 采用血球计数板法测定酵母活细胞数，具体操作参照GB/T 22547－2008进行。

1.2.5 毒性指标测定 分别按GB/T 13091－2002、GB/T 13093 －2006、GB/T 13092 －2006、GB/T 13080－2004、GB/T 13079－2006方法，对重组酿酒酵母工程菌粉中的沙门氏菌、细菌总数、霉菌、铅、总砷等卫生学指标进行测定。

1.2.6 营养成分测定 分别参照饲料的粗蛋白质(GB/T 6432－1994)、粗脂肪(GB/T 6433－2006)、粗纤维(GB/T 6434－2006)、水分和其他挥发性物质含量(GB/T 6435－2006)、粗灰分(GB/T 6438－2007)、淀粉(GB/T 20194－2006旋光法)、总糖(GB/T 15672－2009)、总磷(GB/T 6437－2002分光光度法)、钙(GB/T 6436－2002)氨基酸(GB/T 16631－2008)等方法，对工程菌粉的营养指标进行测定。

1.2.7 蛋白质营养分析 采用FAO/WHO模式和全蛋模式［11］，通过氨基酸评分(Amino Acid Score，AAS)［12］、化学评分(Chemical Score，CS)、必需氨基 酸 指 数 (Essential Amino Acid Index，EAAI)［13，14］、氨基酸比值系数分(Score of RCAA，SRCAA)［11，15］、必需氨基酸相对比值(Essential A-mino Acid Relative Ratio，EAARR)16－18］等多个指标综合评价工程菌粉的蛋白质品质。相关计算公式如下:

AAS=(样品蛋白质中某一种必需氨基酸的含量/参考蛋白质模式中相应必需氨基酸含量)×100(比值较低者为限制性氨基酸，其AAS值就是该氨基酸分)

CS=(样品蛋白质中某一必需氨基酸的相对含量/参考蛋白模式中相应必需氨基酸的相对含量)×100(比值较低者为限制性氨基酸，其CS值就是该化学分)

EAAI=［(ThrP/ThrS)×(ValP/ValS)×……×(LaysP/LysS)］∧(1/n)×100(p为样品蛋白;s为参考蛋白;n为比较的必需氨基酸个数)

RC=待测蛋白质中某一种必需氨基酸的含量(g/100 g pro)/参考蛋白质模式中相应必需氨基酸含量(g/100 g pro)

RCAA=氨基酸比值/氨基酸比值之均数

SRCAA=100(1－CV)(其中CV为RCAA的变异系数，CV=标准差/均数)

EAARR=［1－∑|R－1|/n］×100(R为待测蛋白质中某种氨基酸含量与参考蛋白模式中相对应的必需氨基酸含量的比值，n为待测蛋白质中必需氨基酸的个数)

2 结果

2.1 酵母工程菌粉的感官和理化性状

冻干制备的ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉色泽呈现淡黄色，具有酵母特殊气味、无腐败和异臭味，无异物，外观为粉状或者片状(图1A)，含水量为5.4%，复水后具有正常酵母细胞形态和高活细胞率，复水后活细胞数为267.854亿个/g，符合GB/T 22547－2008标准中饲用活性干酵母粉的感官要求和酵母活细胞数≥150亿个/g及水分含量≤6.0%的理化要求。

2.2 酵母的生长及形态特性

菌体在液体培养基中紧密沉淀于底部，培养液清亮，无浮膜形成(图1B);在麦芽固体培养基上，菌落大而湿润、隆起、乳白色、表面光滑无褶皱、边缘清晰(图1C);显微镜下观察到细胞呈卵圆形或者圆形，单个或者成双，偶尔成簇状，多边芽殖(图1D)。工程菌符合GB/T 22547－2008标准中关于饲用酿酒酵母菌的形态描述。

图1 ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉及其复水生长情况Fig.1 The recombinant yeastpowder with ChIFN－γgene and reactivation growth

2.3 工程菌粉中的有毒有害物质含量

ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉中，细菌、霉菌、铅和总砷含量分别为1.01×104CFU/g、7.1×103个/g、0.41mg/kg 和0.81mg/kg，无沙门氏菌，以上指标检测结果均显著低于GB/T 22547－2008标准中对有毒有害物质要求的最低水平(表1)，制备的酵母工程菌粉符合国家标准的卫生学要求。

表1 Ch IFN－γ酿酒酵母工程菌粉的卫生学检测Tab.1 The hygienic evaluation of recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

2.3 工程菌粉的营养成分

ChIFN－γ重组工程菌粉的灰分、总糖、总磷和总钙含量分别为 4.88%、16.60%、1.41% 和0.41%，均高于野生型菌粉，其粗脂肪(0.02%)与野生型菌粉接近，但粗蛋白质(30.84%)和粗纤维(0.03%)含量却显著低于野生型菌粉(表2)。

工程菌粉中，总必需氨基酸和总非必需氨基酸的含量分别为27.72 mg/g和45.38 mg/g，均高于野生型菌粉。检测的7种必需氨基酸中，甲硫氨酸、赖氨酸和亮氨酸的含量显著高于野生型菌粉，但其苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸4种必需氨基酸的含量则低于野生型菌粉;检测的9种非必需氨基酸中，组氨酸、精氨酸、尤其是甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和丝氨酸的含量均高于野生型菌粉，而其天门冬氨酸、半胱氨酸和脯氨酸含量则比野生型菌粉低(表3)。

AAS和CS分析表明(表4)，酵母工程菌粉的第一限制性氨基酸为苯丙氨酸+酪氨酸，第二限制性氨基酸为缬氨酸。根据FAO模式和全蛋白模式中 EAAI实用评价标准［14］和其它评定依据［11，17，18］，蛋白质营养评价表明(表4)，ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉的 EAAI(22.22)、SRCAA(22.77)和EAARR(77.41)均较低，表明该菌粉中的必需氨基酸与参考蛋白模式差异性较大，不符合理想蛋白模式要求，不宜直接用作蛋白质饲料。

表2 Ch IFN－γ酿酒酵母工程菌粉的主要营养成分Tab.2 Nutrient content of w ild－type yeast and recombinantS.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表3 酵母工程菌粉的氨基酸检测Tab.3 Am ino acid content of w ild－type yeast and recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表4 酵母工程菌粉的蛋白质营养品质分析Tab.4 The protein nutrition and quality analysis of w ild －type yeast and recombinant S.cerevisiae based on the AAS，CS，EAAI，EAARR and SRCAA

3 讨论

饲料中的重金属、病原微生物等有毒有害物质不但影响禽体代谢活动和健康，还会在畜产品中残留［19］，影响人体健康［20］;如沉积在动物肝、肾、肌肉、乳汁及禽蛋等动物产品中的霉菌毒素可通过食物链危害人类健康［21］。本研究中的ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉未检测到沙门氏菌，其细菌和霉菌数、铅和总砷含量均符合国家饲料添加剂标准中的卫生规定，若严格控制制备工艺和过程，还可进一步提高其安全性。

能量和蛋白质营养对家禽生产具有重要作用［22，23，24］，适量的饲粮代谢能和粗蛋白质水平有利于提高产蛋性能［25］和获得最佳繁殖性能［26］。ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉的总糖、总磷和总钙含量较高，可极好的补充日粮能量浓度和矿物质元素，尤其对禽蛋形成极为有利。氨基酸种类和数量决定蛋白质的营养价值［27］，尤其是必需氨基酸的含量和构成比例常常作为评价蛋白质营养价值的根本依据和主要指标。日粮赖氨酸水平与动物生长［28］，［32］、胴体品质［29］、饲料转化率［30］和提高免疫功能［31］密切相关。工程菌粉的总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量较高，尤其是赖氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸3种必需氨基酸的含量显著高于野生型菌粉，但其必需氨基酸之间的差异性较大，粗蛋白质含量较低，这可能和ChIFN－γ工程菌中重组蛋白的表达影响有关。有研究表明，目标产物的诱导表达可严重抑制宿主菌的生长，导致其对外界环境变化的应激力下降［33］。外源蛋白质表达时常常会耗用宿主细胞的大量资源，对宿主造成代谢负荷，引起宿体内的生理生化变化，甚至损害宿主正常的代谢功能［34］。虽然ChIFN－γ酿酒酵母工程菌粉的蛋白模式不属于理想蛋白，不适合直接作为蛋白质饲料使用，但其含有抗病免疫调节功能的重组ChIFN－γ，可以保护受病毒感染的雏鸡和促进生长(未发表数据)，并且该菌粉具有较好的安全性，复水活性高，可作为具有作为抗病免疫调节功能的饲料添加剂进一步开发应用。

［1］Allen PC.Nitric oxide production during Eimeria tenella infections in chickens［J］.Poultry science.1997;76:810 － 13.

［2］Gabriele L，Ozato K.The role of the interferon regulatory factor(IRF)family in dendritic cell developmentand function.Cytokine＆growth factor reviews.2007;18:503－10.

［3］龚非力.医学免疫学［M］.人民卫生出版社，2001.

［4］唐香山，张学文.酿酒酵母表达系统［J］.生命科学研究.2004:106－09.

［5］侯文华，李政一，杨 力，等.利用酒糟生产饲料蛋白的菌种选育［J］.环境科学.1999;1.

［6］陈平洁，陈 庄.饲料酵母在畜禽饲养上的运用及作用机理的探讨［J］.广东畜牧兽医科技.1999;24:35－36.

［7］Whitlow L，HaglerW.Mycotoxins in feeds［J］.Feedstuffs.2002;74:68 －78.

［8］Battacone G，Nudda A，Cannas A，et al.Excretion of aflatoxin M1 inmilk of dairy ewes treated with different doses of aflatoxin B1［J］.Journal of dairy science.2003;86:2667 －75.

［9］杨在宾，刘 丽，杜明宏.我国饲料业的发展及饲料资源供求现状浅析［J］.饲料工业.2008;29:45－49.

［10］秦捷敏，宋 莉，卢凌霄.ChIFN－α酿酒酵母工程菌的发酵条件优化［J］.山地农业生物学报.2014;11:51－54.

［11］颜孙安，林香信，钱爱萍.化学分析法的理想参考蛋白模式及其化学生物价研究［J］.中国农学通报.2010;26:101－07.

［12］Bano Z，Rajarathnam S.Pleurotusmushroom as a nutritious food［J］.TropicalMushrooms Biological Nature and Cultivation Methods P.1982:363－80.

［13］Oser BL.An integrated essential amino acid index for predicting the biological value of proteins［J］.Protein and amino acid nutrition.1959;281.

［14］冯东勋.必需氨基酸指数(EAAI)在饲料中的应用［J］.饲料工业.1997;18:21－22.

［15］朱圣陶，吴 坤.蛋白质营养价值评价——氨基酸比值系数法［J］.营养学报.1988;10:187－90.

［16］赵建幸.蛋白质营养评价新方法的研究——必需氨基酸相对比值法［J］.食品工业.1991;5:38－40.

［17］滕 瑜，李 娟，郭晓华，等.大菱鲆裙边的营养分析及评价［J］.现代食品科技.2013;29:1110－11.

［18］蒲正宇，史军义，姚 俊，等.箭环蝶营养成分分析［J］.中国农学通报.2014;30:307－10.

［19］Kan C，Meijer G.The risk of contamination of food with toxic substances present in animal feed［J］.Animal feed science and technology.2007;133:84－108.

［20］刘美江.饲料中的重金属污染对家禽的危害［J］.山东畜牧兽医.2011;32:53－54.

［21］Robens J，Richard J.Aflatoxins in animal and human health［J］.Reviews of environmental contamination and toxicology:Springer，1992;69－94.

［22］Choct M.家禽饲料能量营养价值的评定系统［J］.中国家禽.2013;12:015.

［23］高 庆，张克英.饲料营养成分对鸡蛋品质的影响［J］.中国饲料.2004:22－25.

［24］刘 伟，刘盛南，李俊营.不同营养水平日粮对蛋用鹌鹑产蛋性能及血清生化指标的影响［J］.安徽农业科学.2014:8617－18.

［25］夏伟光，张罕星，林映才，等.饲粮代谢能和粗蛋白质水平对蛋鸭产蛋性能的影响［J］.动物营养学报.2014;26:3599－607.

［26］朱 翠，蒋宗勇，蒋守群，等.日粮代谢能和蛋白质水平对30—39周龄岭南黄羽肉种鸡繁殖性能的影响［J］.中国农业科学.2012;1:020.

［27］Datta AK.Handbook ofmicrowave technology for food application［M］.CRC Press，2001.

［28］任建民，刘 强.赖氨酸营养研究进展［J］.饲料博览.2009;3:13－15.

［29］刘升军，呙于明.日粮蛋氨酸及赖氨酸水平对雌性肉仔鸡胴体组成的影响［J］.中国畜牧杂志.2001;37:5－8.

［30］Han Y，Baker Dh.Digestible lysine requirementofmale and female broiler chicks during the period three to six weeks posthatching［J］.Poultry science.1994;73:1739 － 45.

［31］王洪荣，季 昀.氨基酸的生物活性及其营养调控功能的研究进展［J］.动物营养学报.2013;25:447－57.

［32］王 彬，李 奇.亮氨酸的代谢及营养生理作用研究进展［J］.饲料研究.2012:14－16.

［33］陈 燏，朱善良.PET质粒表达对宿主菌的影响研究［J］.江苏教育学院学报(自然科学版).2011:30－34+92.

［34］郑志永，关怡新，林东强，等.重组基因表达对大肠杆菌生理的影响［J］.生物加工过程.2004;2:13－17.