胸水酶联免疫斑点检测在结核性胸膜炎中的诊断价值

崔丹　李志惠　赵杰　冯秀莉　刘朋冲　任欣欣　杨永辉

胸水酶联免疫斑点检测在结核性胸膜炎中的诊断价值

崔丹李志惠赵杰冯秀莉刘朋冲任欣欣杨永辉

【摘要】目的探讨胸水酶联免疫斑点检测(ELISPOT)在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法应用ELISPOT试验检测结核性胸膜炎60例和对照组39例胸腔积液中的γ干扰素水平，同时对试验标本进行涂片、培养、聚合酶链反应(PCR)检测TB-DNA及腺苷脱氨酶(ADA)。结果结核性胸膜炎患者胸水ELISPOT检测敏感性为91.7%特异性为84.6%，抗酸染色涂片、结核菌培养、TB-DNA和ADA的敏感性分别为18.3%，21.7%，36.7%和88.3%。结论ELISPOT方法检测胸腔积液γ干扰素可作为结核性胸膜炎的可靠指标，其敏感性高于临床常规检测方法。

【关键词】胸水酶联免疫斑点检测;γ干扰素;结核性胸膜炎

作者单位: 050041石家庄市，河北省胸科医院结核一科

E-mail: shuiqing_2001@ sina.com

结核性胸膜炎是由结核分枝杆菌及其代谢产物引起的胸膜炎症，结核杆菌及其代谢产物进入高敏状态的人体胸腔中，引发T淋巴细胞介导的免疫反应，致使胸膜通透性增加，产生胸腔积液。近年来结核性胸膜炎的发病成上升趋势［1］，其诊断主要依靠临床诊断。目前诊断结核性胸膜炎的金标准仍然是在结核性胸腔积液标本上检测到抗酸杆菌或者胸腔积液中培养出结核分枝杆菌，或在胸膜活检标本中观察到有干酪坏死的肉芽肿组织，并除外其他引起肉芽肿的疾病。由于病原学检测阳性率低，胸膜活检为有创性操作，且具有一定操作风险。所以，目前对于结核性胸膜炎的早期诊断尚缺乏灵敏度及特异度较好的指标。由于结核性胸膜炎治疗效果与治疗早晚密切相关，如果能找到有良好诊断效率的免疫学指标，则能大幅度提高临床的诊断效率，从而提高结核性胸膜炎的治疗效果。酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)是通过检测经抗原刺激后分泌细胞因子的效应T淋巴细胞数量评价细胞免疫功能的方法，具有快速、灵敏等特点［2］。目前已广泛应用于临床上结核感染的诊断［3－5］。据报道，在诊断结核性疾病中有参考价值。基于此，本研究通过ELISPOT方法检测60例结核性及39例非结核性胸腔积液的γ干扰素水平，探讨酶联免疫斑点检测(ELISPOT)在结核性胸膜炎中的诊断价值。

1　资料与方法

1.1一般资料从2011年7月至2012年7月入住我科的胸腔积液患者99例，其中结核性胸膜炎患者60例(结核组)，男33例，女27例;年龄19～63岁，平均年龄(45.3±3.6)岁。结核性胸膜炎诊断标准如下: (1)临床有结核中毒症状; (2)抗结核治疗两个月内临床症状改善，胸水吸收; (3)胸水或痰检可见抗酸杆菌; (4)胸部影像学检查可见结核灶; (5) PPD强阳性; (6)抗结核治疗有效，半年内胸水未复发。非结核性胸腔积液患者39例(对照组)，其中男17例，女22 例;年龄15～67岁，平均年龄(48.6±5.4)岁。对照组经细菌培养、病理学、血清及影像学方法确诊非结核性胸腔积液;其中肿瘤性胸腔积液36例，肺炎旁积液3例。

1.2方法

1.2.1采用英国Oxford Immunotec公司生产的TSpot-TB试剂盒，基本步骤如下:于治疗前分别取枸橼酸钠抗凝新鲜胸腔积液100ml立即进行检测(样本采集后2 h内送实验室，4 h内完成检测)。用ELISPOT计数仪进行斑点阅读与统计。当任一检测孔达到以下标准则判定为阳性结果:①如果空白对照孔斑点数＜5个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数＞6;②如果空白对照孔斑点数＞6个，检测孔斑点数必须＞2倍的空白对照孔斑点数。

1.2.2所收集胸腔积液同步送胸液抗酸染色、结核菌培养、ADA及PCR检测TB-DNA。

1.3统计学分析应用SPSS 18.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.160例结核组患者与39例对照组患者胸腔积液抗酸染色、培养、TB-DNA、ADA和ELISPOT检测敏感性分别为18.3%，21.7%，36.7%，88.3%和91.7%。采用T-Spot-TB试剂盒ELISPOT方法检测分别与抗酸染色、培养、TB-DNA两两比较差异有统计学意义(P ＜0.05) ;与ADA比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1　ELISPOT检测与其他指标在结核性胸膜炎中阳性率比较n=60

2.2结核性胸膜炎组与对照组患者均行胸腔积液ELISPOT检测及ADA检测，ELISPOT检测其敏感性91.7%、特异性84.6%，高于ADA检测敏感性88.3%、特异性74.4%。见表2。

表2　ELISPOT检测及ADA评价指标比较　%

3　讨论

结核性胸膜炎是胸腔积液最常见的病因，有研究显示，结核性胸膜炎占胸膜疾病的49.6%，且发病呈逐年上升趋势［6］。目前诊断结核性胸膜炎的金标准仍然是胸水中找到或培养出结核分枝杆菌，但其阳性率低［7］;胸膜活检创伤较大而限制其临床广泛应用;聚合酶链反应(PCR)检测TB-DNA由于其假阳性率高而影响了结果的可靠性［8］。本研究中，抗酸染色涂片阳性率18.3%，结核菌培养阳性率为21.7%、荧光定量PCR(TB-DNA)的阳性率仅36.7%。因此，找到一种快速、敏感的免疫学诊断指标对结核性胸膜炎的诊断至关重要。

近来，酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospotassay，ELISPOT)检测技术已经成为一种新的结核分枝杆菌感染的快速诊断工具［9］。结核菌感染诱导的细胞免疫以Th1型细胞免疫为主，IFN-γ是其分泌的主要细胞因子。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，具有抗病毒、抗细胞活性及调节免疫系统中其他细胞反应的作用。在机体的抗结核免疫反应中，IFN-γ激活宿主单核细胞，使其在病灶集聚，并控制感染播散，最终形成结核性肉芽肿;且刺激巨噬细胞产生NO，由NO介导巨噬细胞的呼吸爆发，从而杀死结核杆菌［10］。在体外试验中，由PPD刺激后，结核性胸腔积液中的淋巴细胞可产生高浓度的IFN-γ。而结核性胸腔积液中增多的CD4+T淋巴细胞则被认为是IFN-γ的主要来源。T-Spot-TB是利用结核特异抗原:早期分泌抗原靶6 kD (early secretory antigenic target 6000) ESAT-6、培养滤液蛋白10 kD (culture filtrate protein 10 000) CFP-10，通过ELISPOT检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌的新方法。

近年来外周血单个核细胞结核菌特异性IFN-γ ELISPOT检测技术已广泛应用于活动性肺结核的诊断。而直接来源于胸膜腔的胸液较外周血更能准确的反应出疾病的状况［11］。结核性胸膜炎时，人体局部细胞免疫增强，尤其以Th1免疫应答为主，因此IFN-γ水平升高。在各种类型的肺外结核中，结核菌抗原特异效应的T淋巴细胞，可以转移至感染的局部区域［12］，并且释放出各种细胞因子，因而病灶局部结核菌抗原特异效应的T淋巴细胞数量远远高于外周血的数量，即抗原特异效应的T淋巴细胞的隔室化特征。本研究采用ELISPOT检测60例结核性胸膜炎中，55例阳性，其检测的敏感性为91.7%，特异性为84.6%。抗酸染色涂片敏感性18.3%，结核菌培养敏感性为21.7%、荧光定量PCR(TB-DNA)的敏感性为36.7%。经χ2检验，采用T-Spot-TB试剂盒用ELISPOT方法检测结核组与对照组的胸腔积液分别与抗酸染色、结核菌培养、荧光定量PCR两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISPOT方法检测结核组与对照组的胸腔积液与ADA比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究结果显示ELISPOT检测的敏感性远高于抗酸染色涂片、结核菌培养、荧光定量PCR等常规胸水检测项目。

ADA是人体嘌呤核苷代谢中催化腺苷和脱氧腺苷生成次黄苷和脱氧次黄苷的一种酶。ADA广泛存在于全身各组织细胞中，淋巴细胞特别是T淋巴细胞内的含量最高。ADA的活性增高与T细胞的激活、增殖与分化相关。结核性胸膜炎时，T细胞受到抗原刺激增多，其A DA在胸腔积液中的含量也明显增高。腺苷脱氨酶ADA作为传统诊断结核性胸膜炎的重要辅助指标已有广泛报道，本研究中ADA检测60例结核性胸膜炎中，53例阳性，敏感性88.3%，特异性74.4%。而ELISPOT检测的敏感性为91.7%，特异性为84.6%要更高于ADA检测。提示结核性胸膜炎胸液ELISPOT检测在结核性胸膜炎的早期诊断中具有较胸液ADA检测更高的敏感性，可作为诊断结核性胸膜炎的重要辅助诊断指标。如果ELISPOT检测同ADA检测联合则可进一步提高结核性胸膜炎的诊断效率，使患者得到及早的诊断及治疗。

有研究表明，ELISPOT检测的结果其斑点数与结核活动程度相关，但并不能精确地区分出潜伏感染与活动性结核［13］。本研究结果显示39例非结核性胸膜炎的对照组中，6例ELISPOT检测的结果阳性，其阳性率15.4%，使得ELISPOT检测的特异度偏低。综上所述，ELISPOT检测技术诊断结核性胸膜炎其敏感性较高，在结核性胸膜炎的早期诊断中具有一定的辅助诊断价值。本次研究受到样本量的限制，尚需扩大样本量进一步证实此次试验结论。

参考文献

1杜凤娇，陈曦，刘菲，等.不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较.北京医学，2011，33: 981-985.

2Lalvani A，Pathan AA，Mcshane H，et al.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells.Am J Respir Crit Care Med，2001，163: 824-828.

3Richeddi L.An update on the diagnosis of tuberculosis infection.Am J Respir Crit Care Med，2006，174: 736-742.

4Richeddi L，Losi M，Cerri S，et al.Using ELISPOT technology to improve the diagnosis of tuberculosis infection: From the bench to the T-SPOT.TB assay.Expert Rev Respir Med，2008，2: 253-260.

5Murakami S，Takeno M，Kobayashi M，et al.ELISPOT response to Mycobacterium tuberculosis antigens for diagnosing and monitoring tuberchlosis patients therapy.Kansenshogaku Zasshi，2009，83: 229-235.

6Trajman A，Pai M，Dheda K，et al.Novel tests for diagnosing tuberculous pleural effusion: what works and what does not Eur Respir J，2008，31: 1098-1106.

7曹月琴，朱明林，苏白龄.ADA、IFN-γ在鉴别诊断结核性和恶性胸腔积液中的价值.临床肺科杂志，2012，17: 1666-1667.

8韦海旭，席薇莲，陆利欢，等.γ-干扰素释放分析T-SPOT.TB在结核性疾病中的诊断价值.临床肺科杂志，2012，17: 1439-1440.

9贾红彦，兰汀隆，刘菲，等.酶联免疫斑点试验在骨关节结核中的辅助诊断价值。北京医学，2012，34: 867-870.

10李铁成.γ干扰素、腺苷脱氨酶对结核和非结核性胸腔积液的诊断价值.临床肺科杂志，2007，12: 1222-1235.

11廖明凤，邓永聪，陈涛，等.胸液标本结核分枝杆菌特异性IFN-γ酶联免疫斑点技术的建立及其应用.2011年中国防痨协会全国学术会议论文集，328-331.

12Barnes PF，Lu S，Abrams TS，et al.Cytokine production at the site of disease in human tuberculosis.Infect Immun，1993，61: 3482-3489.

13马丽萍，刘菲，张宗德.结核病不同抗原酶联免疫斑点检测的影响因素分析.中国防痨杂志，2010，32: 643-646.

(收稿日期:2014－11－21)

通讯作者:杨永辉，050041河北省胸科医院结核一科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.024

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1191－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 521.7