去骨瓣减压对大鼠心肺复苏后大脑中动脉血流、NF-κB及NSE蛋白表达的影响

冯凯　王瑞刚　赵春香　张磊

去骨瓣减压对大鼠心肺复苏后大脑中动脉血流、NF-κB及NSE蛋白表达的影响

冯凯王瑞刚赵春香张磊

【摘要】目的探讨去骨瓣减压术对心肺复苏大鼠大脑中动脉血流的变化及NF-κB和NSE蛋白表达的影响。方法采用改良的窒息法制备大鼠复苏模型，成年雄性Wistar大鼠48只，随机分为假手术组、对照组和去骨瓣干预组，每组16只。每组又分为A(6 h)、B(12 h)、C(24 h)、D(48 h) 4个亚组。对照组与去骨瓣干预组采用窒息致大鼠心脏骤停(CA)和心肺复苏(CPR)模型。去骨瓣干预组在大鼠心肺复苏成功1 h后行去骨瓣减压。假手术组仅行气管插管、股动静脉置管术。激光多普勒血流仪(LDF)监测大鼠心肺复苏前后大脑中动脉血流的变化。在不同的时间点取大鼠静脉血，离心留取血清，采用Elisa方法，检测血清中NSE蛋白的表达，然后断头取脑，测定脑组织含水量，免疫组化检测NF-κB表达，并分析其相关性。结果大脑中动脉血流:与假手术组比较，对照组、去骨瓣干预组大脑中动脉血流在自主循环恢复(ROSC)后6 h降低，并持续降低至48 h，差异有统计学意义(P＜0.05) ;与对照组比较，去骨瓣干预组大脑中动脉血流在自主循环恢复(ROSC)后6 h至48 h降低幅度较小，6 h、12 h、24 h、48 h差异有统计学意义(P＜0.05)。脑组织含水量:心肺复苏成功后脑组织含水量于6 h开始升高，24 h达高峰，持续至48 h。假手术组脑组织含水量正常，对照组最高，去骨瓣干预组处于两者之间。对照组和去骨瓣干预组比较，6 h、12 h、24 h差异有统计学意义(P＜0.05)。血清中NSE蛋白的浓度:与假手术组比较，对照组血清NSE蛋白在自主循环恢复(ROSC) 后6 h明显升高，并持续上升至12 h达峰值，24 h、48 h有所回落，差异有统计学意义(P＜0.01) ;与对照组比较，去骨瓣干预组ROSC后12 h、24 h、48 h血清中NSE蛋白的浓度显著降低(P＜0.01)，但6 h差异无统计学意义(P＞0.05)。NF-κB的表达:心肺复苏后6 h脑组织NF-KB活性即增高并逐渐增强，于伤后24 h达高峰后迅速下降;对照组与去骨瓣干预组变化曲线相似，但对照组在每个时间点的阳性细胞数均高于去骨瓣干预组，其中在24 h、48 h差异有统计学意义(P＜0.01)，12 h差异有统计学意义(P＜0.05)，但6 h差异无统计学意义(P＞0.05)。结论去骨瓣减压能改善心肺复苏后大脑中动脉血流速度，改善大鼠心肺复苏后大脑中动脉血流量，从而减轻脑损伤;去骨瓣减压能够减轻脑水肿从而保护脑组织，减轻继发性脑损伤，降低其病死率;心肺复苏后NSE蛋白浓度的升高反映脑损伤的程度，去骨瓣干预组于12 h、24 h、48 h NSE蛋白浓度较对照组明显降低，去骨瓣减压能够降低NSE蛋白的表达，减轻脑损伤;心肺复苏成功12 h后对照组NF-κB表达水平比去骨瓣干预组高而且下降缓慢，提示它的持久激活可能是加重继发性脑损伤的因素之一;

【关键词】心肺复苏;去骨瓣减压;大脑中动脉血流;激光多普勒血流仪;脑水肿; NSE蛋白; NF-κB

项目来源:河北省医学科学研究指令性课题(编号: ZL20140143)

作者单位: 063000河北省唐山市，河北联合大学附属医院NICU

E-mail: wangrg123@ tom.com

去骨瓣减压手术最早被应用于解除当时无法定位的脑部肿瘤引起的颅内压升高，以后被越来越多的实验研究和临床治疗证实此术式的疗效［1－3］。采用超早期标准大骨瓣减压术对重度颅脑损伤患者进行治疗可减少脑梗塞体积、保护半暗带，改善神经功能，降低病死率，但该项手术治疗技术并未用于临床心脏骤停复苏脑保护中［3］。本研究通过动物实验进一步探索去骨瓣减压术是否在治疗心跳骤停复苏脑保护方面有好的疗效，并可做为心跳骤停复苏脑保护早期较好的治疗方法。本实验用LDF监测大鼠大脑中动脉血流，拟通过应用LDF监测大鼠心肺复苏后及去骨瓣减压后大鼠大脑中动脉血流的动态变化［4］，并观察大鼠心肺复苏(CPR)后血清NSE蛋白和NF-κB表达的变化，评价去骨瓣减压对心肺复苏后脑保护的价值。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组成年清洁级雄性Wistar大鼠48只，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心［许可证号: SCXK-(军) 2009－003］，体重280～380 g，随机分为假手术组、对照组、去骨瓣组，每组16只，再分别按气管插管+股动静脉置管术后(假手术组)或自主循环恢复(ROSC)后(对照组、去骨瓣组) 6 h、12 h、24 h、48 h分为4个亚组，每个亚组4只。实验前禁食12 h，不禁水。

1.2实验模型制作参照参考文献7的方法制作窒息性心跳骤停模型。腹腔注射9%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉，固定于鼠头定位仪上，沿矢状线起开头皮，分离组织，用医用棉签擦拭筋膜，显露颅骨矢状线及前囟，用鼠头定位仪定位前囟下2 mm、旁5 mm处，之后电动牙科钻于定位点打孔，打孔以不打通颅骨为宜，用PF 5010 LDF监测大脑中动脉血流，将光纤探头用生物凝胶固定于打孔部位，连续1 h监测大脑中动脉血流数值。1 h后取下大鼠，将大鼠固定于手术板上，针状电极置于皮下，监测ECG。分别行气管插管和右侧股动、静脉置管术。气管插管后连接TKR-200C小动物呼吸机，行高频喷射通气，吸入空气，通气频率80次/min，通气压力＜0.02 MPa，根据大鼠胸廓起伏及呼吸是否抵抗调节通气频率。经右股静脉输注乳酸钠林格0.01 ml·g－1·h－1，股动脉接换能器监测动脉压及心率稳定10 min。复苏液:肾上腺素40 μg/kg。窒息前5 min静脉注射维库溴铵0.1 mg/kg、肝素500 U/kg。夹闭气管导管直至ECG和有创动脉监测示心电机械分离或心电活动消失，且MAP＜20 mm Hg，8 min后经右股静脉插管注入复苏液，同时开放气道，行机械通气，并行心外按压(按压频率200次/min，深度为胸廓前后径的1/3)，动脉波形恢复且MAP＞40 mm Hg为按压有效，自主循环恢复(MAP＞60 mm Hg，HR＞250次/min)为复苏成功。死亡或复苏时间超过10 min的大鼠剔除本研究，重新补充。1 h后结扎动静脉，缝合皮肤，拔出气管插管，完成窒息性心跳骤停复苏模型。假手术组动物仅进行麻醉和气管插管、股动静脉置管，不进行夹管窒息及CPR。1.3去骨瓣干预治疗去骨瓣组大鼠于窒息性心跳骤停复苏模型成功1 h后，切开头皮，擦拭分离筋膜，完全暴露另一侧顶骨，用显微牙科钻在顶骨边缘上均匀的打孔，配合牙科镊将大鼠一侧顶骨取下，骨瓣大小约9 mm×5 mm，放射状切开硬脑膜，止血、缝合头皮。1.4术后大脑中动脉血流的监测各亚组大鼠分别于6、12、24、48 h后，再次监测大脑中动脉血流值，将鼠头固定于定位仪上，拆开缝合线，显露颅骨定位打孔点，再次用PF 5010 LDF监测大脑中动脉血流，将光纤探头用生物凝胶固定于打孔部位，连续1 h监测大脑中动脉血流数值。

1.5标本的采集每亚组大鼠分别于术后6、12、24、48 h后腹腔麻醉，立即开胸暴露心脏，迅速取大鼠上腔动脉血2 ml(待离心)，之后速断头取脑，每只大鼠分别于矢状线切开大脑，一半脑组织用于测定含水量，另一半迅速用4%多聚甲醛液固定24 h后常规脱水、石蜡包埋，每个标本连续切片2张，切片厚度5 μm，一张切片用于HE染色，另1张用于NF-KB免疫组化染色实验。将每只大鼠留取的静脉血离心(3 500 r/min，10 min)，取上清液于EP管，置于－80℃冰箱保存，批量待测。测定血清NSE蛋白浓度，测定步骤严格按试剂盒操作说明进行。

1.6脑组织含水量测定用干湿重法测定脑含水量:将各时间点所取脑组织用滤纸吸尽脑表面血渍后，取脑组织约100 mg，称得湿重值(Wetweight，WW)，然后在100℃干烤箱中持续烘干24 h，取出并称得干重值(Dryweight，DW)，脑组织含水量计算公式为(WWDW)/WW。

1.7NF-KB免疫组化采用链霉素亲和素-生物素-过氧化酶复合物法(SABC)，参照试剂盒说明书进行染色，一抗为NF-κB p65 (F-6) (浓度为1∶50)，使用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗进行免疫组化染色。每张切片随机选取10个不重复视野(各组所选部位尽可能相同)，在高倍(10×40)镜下观察(相同条件)，运用HMIAS-2000高清晰度图像采集处理系统采图。阳性细胞测定采取直接计数法:计算每个视野下阳性细胞数目，每个时间点6张切片的阳性细胞数目取其均值表示各切片的测定结果。

1.8统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，数据间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.13组大鼠大脑中动脉血流值的变化与假手术组比较，对照组、去骨瓣组大脑中动脉血流在自主循环恢复(ROSC)后6 h降低，并持续降低至48 h，差异具有统计学意义(P＜0.05) ;与对照组比较，去骨瓣干预组大脑中动脉血流在自主循环恢复(ROSC)后6 h 至48 h降低幅度较小，6 h、12 h、24 h、48 h差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1　3组大鼠大脑中动脉血流量的变化　n=4，pU/min，±s

表1　3组大鼠大脑中动脉血流量的变化　n=4，pU/min，±s

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与去骨瓣组比较，#P＜0.05，△P＜0.01

组别0 h　6 h　12 h　24 h　48 h假手术组　231.930±21.393　234.278±24.383　237.923±13.291　229.748±16.704　228.055±21.629对照组　209.935±11.975*　189.018±9.476*　166.135±23.354*　112.105±12.169*　99.628±4.902*去骨瓣组　258.250±27.015*　246.665±28.251* #　233.053±25.519* #　210.665±24.336＊△　201.150±21.428*#

2.23组大鼠脑组织含水量变化心肺复苏成功后脑组织含水量于6 h开始升高，24 h达高峰，持续至48 h。假手术组脑组织含水量正常，对照组最高，去骨瓣干预组处于两者之间。对照组和去骨瓣干预组比较，6 h、12 h、24 h差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　3组大鼠脑组织含水量变化　n=4，%，±s

表2　3组大鼠脑组织含水量变化　n=4，%，±s

注:与假手术组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与去骨瓣干预组比较，△P＜0.05，☆P＜0.01

组别6 h　12 h　24 h　48 h假手术组　78.58±0.45　78.12±0.39　77.92±0.41　78.37±0.49对照组　79.98±0.53#　80.49±0.60#　81.46±0.47#　81.49±0.50#去骨瓣组　79.17±0.44＊△　79.72±0.41#△　80.83±0.52#☆　80.77±0.46#

2.33组大鼠血清中NSE蛋白浓度的变化与假手术组比较，对照组血清NSE蛋白在自主循环恢复(ROSC)后6 h明显升高，并持续上升至12 h达峰值，24 h、48 h有所回落，差异具有统计学意义(P＜0.01) ;与对照组比较，去骨瓣干预组ROSC后12 h、24 h、48 h血清中NSE蛋白的浓度显著降低(P＜0.01)，但6 h差异无显著性(P＞0.05)。见表3。

表3　3组大鼠血清NSE蛋白含量的变化　n=4，μg/L，±s

表3　3组大鼠血清NSE蛋白含量的变化　n=4，μg/L，±s

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与去骨瓣干预组比较，#P＜0.01

组别6 h　12 h　24 h　48 h假手术组　597.375±9.513　662.425±49.576　645.125±63.326　638.925±62.707对照组　1460.000±216.506*　2228.750±205.523*　1766.250±108.733*　1503.750±89.849*去骨瓣组　1472.500±136.931*　1716.250±119.678* #　1491.250±96.555* #　1416.250±82.601*#

2.43组大鼠NF-κB阳性表达细胞数比较心肺复苏后6 h脑组织NF-κB活性即增高并逐渐增强，于伤后24 h达高峰后迅速下降;对照组与去骨瓣干预组变化曲线相似，但对照组在每个时间点的阳性细胞数均高于去骨瓣干预组，其中在12 h、24 h、48 h差异有统计学意义(P＜0.05)，但6 h差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表4。

表4　3组大鼠NF-κB阳性表达细胞数比较n=4，±s

表4　3组大鼠NF-κB阳性表达细胞数比较n=4，±s

注:与去骨瓣干预组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

组别6 h　12 h　24 h　48 h对照组32.2±4.53　51.2±4.76　58.4±5.25　27.6±3.78去骨瓣组　28.5±4.08　46.5±3.41*　49.3±3.99* #　20.8±3.07*#

2.5HE染色观察组织结构及细胞形态结构对照组:大脑皮层及海马可见不同程度的神经元细胞损伤表现。心肺复苏后6 h组:可见大脑皮层及海马区神经元细胞轻度水肿，部分细分细胞核浓染，固缩。心肺复苏后12 h组:神经元细胞水肿加重，神经毡疏松，大量细胞核浓染，固缩，局部可见少量三种深染单核淋巴细胞浸润。心肺复苏后24 h组:神经元坏死明显，数量减少，呈空泡状，现存的细胞大部分固缩深染，核仁消失，部分核碎裂、溶细胞核固缩深染，核仁消失，部分细胞溶解，甚至消失，脑质细胞增生;神经毡明显疏松，但组织结构轮廓尚存。心肺复苏后48 h组:神经细胞失去完整结构，核碎裂明显，细胞周围高度水肿，可见胶质细胞增生。去骨瓣组: 6 h较对照组未见明显变化，12 h、24 h、48 h后大脑皮层及海马可见神经元细胞坏死减少，胶质细胞增生，大量新生毛细血管。假手术组:神经细胞数量及形态结构分布正常，未见神经元病理性损伤。

3　讨论

3.1大脑中动脉血流与心肺复苏脑对缺血与再灌注的天然脆弱性导致心脏骤停后脑损伤的后果尤为严重。大量神经细胞受损导致患者出现相应的神经功能障碍，严重的出现昏迷、持续植物状态甚至死亡。心脏骤停后脑损伤的发生机制非常复杂。目前认为，缺血缺氧是导致心肺复苏后神经功能损伤的始动因素，引起包括细胞内酸中毒、钙超载、兴奋性氨基酸蓄积、氧自由基损伤以及细胞死亡通路的激活在内的一系列复杂的级联反应［6］。这些级联反应在脑组织缺血缺氧后4～6 min即刻发生，在自主循环恢复后仍可持续数小时至数日，中枢神经系统的海马、皮层、小脑、纹状体与丘脑的“选择性易损神经元”，可见变性、退化乃至坏死。针对复苏后脑损伤治疗的药物很多，但效果均不理想。心跳骤停后，由于缺血缺氧导致大脑水肿，进而导致大脑血流量降低，去骨瓣减压从外科学角度，去除部分颅脑，从而达到减轻颅内高压，缓解颅内高压造成的脑细胞供血不足，本实验以此为出发点，通过心肺复苏后去除大鼠颅脑顶骨，减轻颅内高压，对照组、去骨瓣组分别于6、12、24、48 h大脑中动脉血流值明显较假手术组低，且呈逐渐降低趋势。而去骨瓣组较对照组血流值下降幅度小，降低趋势也较平缓。本研究结果证明去骨瓣减压对心肺复苏成功后脑血流的恢复具有积极意义，在早起起到缓解颅内高压，增高脑血流量的目的［7，8］。从早期改善心肺复苏的预后。

3.2NSE与心肺复苏神经元特异性烯醇酶(NSE)是糖酵解途径中的关键酶，普遍存在于生物体内的糖酵解代谢中，由三种亚基(A、B、C)组成5种烯醇化酶，其中rr型特异地存在于神经元和神经内分泌细胞的胞浆中，称为NSE。NSE与乳酸脱氢酶、醛缩酶、肌酸激酶不同，它不与细胞内肌动蛋白结合，因而最易释放出来。NSE是反映脑损伤最灵敏且意义最大的指标。脑损伤后，NSE可以从缺血/损伤的神经元中漏出，跨过血脑屏障进入体循环。因而使血中NSE上升，故反映了中枢神经系统受损情况，且血标本比CSF更易取得。因而检测血浆或血清中的NSE具有重要意义。本研究结果显示，血清中NSE蛋白的浓度在自主循环恢复后6 h明显升高，并持续上升至12 h达高峰，之后有所回落，去骨瓣干预组ROSC后血清中NSE蛋白的浓度显著降低，反映了去骨瓣干预对心肺复苏后脑保护起到了积极作用，减少脑细胞死亡率。

3.3NF-KB与心肺复苏研究认为NF-κB在炎性反应时的内皮细胞中起枢纽作用。因此我们推测: (1)脑损伤后早期NF-κBp65在血管内皮细胞和神经胶质细胞中即可被激活，提示NF-κB在调控自由落体脑损伤后的多个病理生理过程中，这两类细胞可能起主要作用;内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤，炎性损伤起初发生在脑的微血管内皮细胞和神经胶质细胞，随即累及周围的神经组织; (2)对照组24 h后NF-κB表达水平相对较高且下降缓慢，提示它的持久激活可能是加重继发性脑损伤的因素之一，而去骨瓣干预组24 h后NF-κB在低水平表达且持续下降，提示其炎性反应较轻，去大骨瓣减压可能间接通过降低NF-κB表达继而减轻炎性反应来减轻脑损伤。

参考文献

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(收稿日期:2014－11－20)

通讯作者:王瑞刚，063000河北联合大学附属医院NICU;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.013

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1163－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 605.974