膳食变化对大鼠下丘脑AgRP表达的影响

吕亮　张丹　贝雪艳　乔跃兵

膳食变化对大鼠下丘脑AgRP表达的影响

吕亮张丹贝雪艳乔跃兵

【摘要】目的分析膳食变化对大鼠下丘脑刺鼠相关蛋白(AgRP)表达的影响，探讨AgRP在肥胖发生中的作用，为肥胖的研究提供一个新的思路。方法将80只体重为100～120 g的雄性Wistar大鼠随机分成高能饲料组(n=40)、饥饿组(n=20)、对照组(n=20)。高能组给予自制的高能饲料，对照组和饥饿组给予基础大鼠饲料。12周后，高能组体重超过对照组平均体重30%的大鼠设为膳食诱导肥胖(DIO)组，饥饿组给予72 h禁食，自由饮水。取大鼠下丘脑采用免疫组化实验和western blot检测AgRP表达。结果免疫组化显示DIO组大鼠和饥饿组大鼠下丘脑AgRP表达显著高于对照组(P＜0.05) ;而DIO组大鼠和饥饿组下丘脑AgRP表达差异无统计学意义(P＞0.05)。Western Blot实验显示DIO组和饥饿组大鼠下丘脑AgRP表达明显高于对照组大鼠(P＜0.01)。而DIO组大鼠和饥饿组大鼠下丘脑AgRP表达差异无统计学意义(P＞0.01)。结论长期高能饮食导致肥胖，其下丘脑内AgRP表达的增高可能是导致机体摄食量和体重增加并引起肥胖的主要因素之一。饥饿状态下，下丘脑内AgRP表达增高，可能是由于在饥饿状态下机体内瘦素、胰岛素、糖的减少共同所致。

【关键词】高能饮食;饥饿;食源性肥胖;刺鼠相关蛋白;下丘脑弓状核

项目来源:河北省科学研究与发展支撑计划项目(编号: 08276101D-20)

作者单位: 067000河北省承德市，承德护理职业学院(吕亮、贝雪艳) ;承德医学院附属医院(张丹) ;承德医学院研究生处(乔跃兵)

刺鼠相关蛋白(agouti-related protein，AgRP)又称之为刺鼠相关肽。AgRP作为神经肽Y(NPY)的同源性物质，是一种强效和长效的食欲刺激物质。下丘脑中的AgRP可竞争结合黑素皮质素受体3和黑素皮质素受体4(MC3-R和MC4-R)，拮抗a-黑素细胞刺激素(a-melanocyte-stimulating hormone，a-MSH)，从而促进食欲和减少能量的消耗，导致肥胖。最近的研究显示AgRP不禁可以增加食欲，而且对食物的选择性摄取也有显著影响，可以选择性增加高脂、高热量食物的摄入，本研究探讨膳食改变对AgRP表达的影响及其在肥胖发生中的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物80只雄性SPF级Wistar大鼠，体重100～120 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号: SCXK(京) 2007-0001。大鼠随机分为3 组:高能饲料组(n=40)给予自制高能饲料;对照组(n=20)给予基础大鼠饲料;饥饿组(n=20)给予基础大鼠饲料。喂养12周后，高能饲料组动物体重超过对照组平均体重30%者，设为膳食诱导肥胖组(DIO 组) ;体重未超过对照组平均体重的大鼠，弃之不要。对照组继续喂养，饥饿组的大鼠在喂养12周后，禁食72 h，期间自由饮水，断头取脑组织。

1.2动物饲料对照组给予基础大鼠饲料;高能饲料组制作方法如下:按照100 g标准动物饲料，加25 g熔化的猪油、17 g白糖和17 g鸡蛋、8.4 g奶粉的比例混匀，加适量水，用搅拌机搅匀，将配好的饲料机制成标准饲料大小的团块，阴干备用。

1.3主要试剂兔抗大鼠AgRP多克隆抗体(稀释度: 1∶500)，美国Santa Cruz公司，蛋白marker(美国Fermentas公司)，兔抗大鼠β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，稀释度: 1∶1 000)，羊抗兔二抗(美国KPL公司稀释度1∶5 000)，免疫组化试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.4方法

1.4.1取材: DIO组、饥饿组和对照组大鼠各20只，用6%的水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，迅速断头取脑组织，以视交叉和乳头体后缘的冠状面为界取下丘脑组织，将样品保存于液氮罐中备用。

1.4.2免疫组化检测: AgRP在下丘脑弓状核表达的变化:每组取5例下丘脑组织，包埋，切片，行免疫组化染色，一抗浓度为1∶500。图像采用ImagePro Plus 6.0软件进行分析，每张切片随机取10个视野，测定每个视野累计光密度(IOD)值，以10个视野的平均值来表示。

1.4.3Western Blot检测下丘脑AgRP表达的变化:各组取15例下丘脑组织，提取蛋白并定量。制胶、上样、电泳、转膜、Ⅰ抗孵育2 h，兔抗大鼠AgRP多克隆抗体(1∶500)、Ⅱ抗孵育2 h，羊抗兔二抗(1∶5 000)，显影。胶片扫描图像用Bandleader(3.0)软件进行灰度分析，计算目的蛋白条带与内参照(β-actin)的灰度比值。

1.5统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，各组间资料比用方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.13组大鼠下丘脑AgRP的表达(IHC)AgRP表达在下丘脑弓状核胞浆内，呈棕黄色。DIO组和饥饿组着色细胞数多、着色深。大鼠AgRP表达的累计光密度(IOD) DIO组(5 531±330)和饥饿组(4 902±410)明显高于对照组(920±326)，差异有统计学意义(P＜0.01)，高能饲料组与饥饿组AgRP蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1，图1～6。

表1　3组大鼠下丘脑AgRP表达比较　n=5，±s

表1　3组大鼠下丘脑AgRP表达比较　n=5，±s

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别IOD对照组920±410 DIO组　5 531±330*饥饿组　4 902±326*

图1　AgRP在对照组的表达(免疫组化×100)

图2　在对照组的表达(免疫组化×400)

图3　AgRP在DIO的表达(免疫组化×100)

图4　AgRP在DIO组的表达(免疫组化×400)

图5　AgRP在饥饿组的表达(免疫组化×100)

图6　AgRP在饥饿组的表达(免疫组化×400)

2.23组大鼠下丘脑组织中AgRP的表达情况

14kD处均可见清晰目的条带。内参条带清晰，亮度均一，无其他杂带。高能饲料组(0.99±0.01)、饥饿组(0.87±0.02)表达较对照组(0.67±0.01)明显升高(P＜0.05)。高能饲料组与饥饿组AgRP蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2、图7。

表2　3组大鼠下丘脑组织中AgRP表达n=15±s

表2　3组大鼠下丘脑组织中AgRP表达n=15±s

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别　Ratio of optical density (Agrp/β-actin) DIO组　0.99±0.01*对照组　0.62±0.02饥饿组　0.87±0.01*

3　讨论

肥胖引起的原因非常复杂，是由内在的因素和外在的因素长期共同作用所致，脑内神经递质对机体能量代谢的影响一直是学者研究的重点。脑内神经递质分两类，一类是促进食欲的神经肽，如NPY、AgRP等;另一类是抑制食欲的神经肽，如α-MSH、CART等。AgRP的研究在国外开展的较多，也是能量代谢研究的一个新领域，这方面的研究在国内开展的较少，随着越来越多的学者对AgRP认识和研究的深入，人们逐渐提出这样一个问题: AgRP在能量代谢中的角色是什么，在肥胖发生的过程中AgRP又起着什么样的作用。

AgRP是大脑内AgRP/NPY神经元产生的一种肽，又称之为刺鼠相关肽。是由132个氨基酸组成的旁分泌信号分子，组成大鼠AgRP的132个氨基酸和人类AgRP的氨基酸组成有81%是一致的。AgRP主要表达在下丘脑和肾上腺组织，在睾丸、肾和肺脏的表达较低。AgRP已被证实是黑皮质素受体的反向激动剂，尤其是对MC-3R和MC4-R。黑皮质素受体MC3-R 和MC4-R与新陈代谢和体重有着直接的关系，这些受体通常被促黑激素(α-MSH)激活，而被AgRP所抑制。促黑激素对大多数的黑皮质素受体有激活作用(除外MC2-R)，然而AgRP仅仅对MC3-R and MC4-R有高度特异性。AgRP的这种反向激动作用不仅仅对黑皮质素，比如α-MSH起作用，更能通过受累的细胞减少cAMP的生成。AgRP抑制黑皮质素受体信号的确切机制目前还不完全清楚，有人认为AgRP和α-MSH结合扮演着一个配体结合的竞争性拮抗剂作用［1］。由于AgRP和NPY由同一神经元产生，能影响NPY合成与释放的因素也同样能影响AgRP。作为NPY的同源性物质，AgRP在促进饮食、增加体重方面的作用比NPY要更加持久［2］。饥饿、ob/ob和db/db小鼠的AgRPmRNA表达明显上调［3］。正常小鼠和ob/ob小鼠注射Leptin可以抑制AgRPmRNA的表达。有试验显示.Leptin通过作用于ARC的NPY/AgRP神经元来影响NPY和AgRP的释放。

在本次试验的过程中，40只Wistar大鼠在长达12周的高脂饮食喂养下，有27只大鼠发展成DIO大鼠，高达近70%的比例，这一数据充分说明了饮食因素在肥胖发展中的重要性。

据国外文献报道，长期进行高脂高热量喂养发展为肥胖的大鼠，其下丘脑弓状核内AgRP的表达会显著地增高，提示AgRP的表达增高可能是导致大鼠肥胖的重要原因［4］。本次实验的结果显示，DIO大鼠无论在Western Blot实验还是免疫组化，其下丘脑内的AgRP的表达都明显的高于对照组，这一结果与国外的报道一致，提示DIO大鼠下丘脑内AgRP表达的上调是导致大鼠肥胖的重要因素之一。

有资料显示，在大鼠喂养状态下，瘦素能够抑制AgRP的表达，但是这种抑制在以下情况会被解除: (1)瘦素或功能性的瘦素受体缺乏; (2)在饥饿状态下循环中的瘦素水平下降［5－7］。

在本次实验中，饥饿组的大鼠在经过12周的普食喂养，人为给予72 h的禁食后，Western Blot和免疫组化研究结果同对照组比较显示下丘脑内AgRP的表达也显著的增高，可能是由于饥饿使瘦素水平下降，对AgRP的抑制减弱，AgRP表达增强［7］。

图7　3组Agrp在下丘脑弓状核中的表达

参考文献

1Ollmann MM，Lamoreux ML，Wilson BD，et al.“Interaction of Agouti protein with the melanocortin 1 receptor in vitro and in vivo”.Genes Dev，1998，12: 316-330.

2Schwartz MW，Woods SC，Porte D，et al.Central nervous system control of food intake.Nature，2000，404: 661-671.

3Lin S，Storlien LH，Huang XF.Leptin receptor，NPY，POMC mRNA expression in the diet-induced obese mouse brain.Brain Res，2000，875: 89-95.

4Gao J，Ghibaudi L，Vail HM.Characterization of diet—induced obese rats that develop persistent obesity after 6 months of high—fat followed by 1 month of low-fat diet.Brain Res，2002，936: 87-90.

5Shutter JR，Graham M，Kinsey AC，et al.Hypothalamic expression of ART，a novel gene related to agouti，is up-regulated in obese and diabetic mutant mice.Genes Dev，1997，11: 593-602.

6Wilson BD，Bagnol D，Kaelin CB，et al.Physiologic and anatomic circuitry between Agouti-related protein and leptin signaling.Endocrinology，1999，140: 2387-2397.

7Mizuno TM，Mobbs CV.Hypothalamic agouti-related protein messenger ribonucleic acid is inhibited by leptin and stimulated by fasting.Endocrinology，1999，140: 814-817.

Effect of dietary change on the expression of AgRP in hypothalamus of rats

LV Liang*，ZHANG Dan，BEI Xueyan*，et al.*
Nursing Occupational College of Chengde City，Hebei，Chengde 067000，China

【Abstract】Objective To observe the effect of dietary change on the expression of AgRP in hypothalamus of rats，and to explore the action mechanism of AgRP in pathogenesis of obesity.Methods Eighty male Wistar rats weighted 100～120g were randomly divided into high-energy diet group (n=40)，hunger group (n=20)，control group (n=20).The rats in high-energy diet group were given self-made high-energy food，the rats in control group and hunger group were fed with basal food.After 12 weeks，the rats in high-energy diet group whose weight exceeded 30% of mean weight in control group were regarded as diet-induced obesity group (DIO group)，however，the rats in hungry group were fasted for 72h，free to drink in the meantime.Then the expression levels of AgRP were detected by immunohistochemistry (IHC) and Western Blotting for all the rats.Results The results by IHC showed that the expression levels of AgRP in hypothalamus of rats in DIO group (5531.10 ±330.40) and hungry group (4901.67±410.24) were significantly higher than those in control group(919.62±325.98) (P＜0.01)，however，there were no significant differences between DIO group and hungry group (P＞0.05).The results by Western blotting showed that the expression levels of AgRP in hypothalamic of rats in DIO group(0.99±0.01) and hungry group(0.87±0.02) were significantly higher than those in control group(0.67±0.01) (P＜0.01)，but there were no significant differences between DIO group and hungry group (P＞0.05).Conclusion Long-term high-energy diet can result in obesity，and the overexpression of AgRP in hypothalamus may be one of the main factors which can lead to the increase of food intake，weight gain and obesity.During starvation condition，the increase of AgRP expression in hypothalamus may be caused by the common effects of the reduction of leptin，insulin and sugar within organism.

【Key words】high-energy diet; hunger; diet-induced obesity; agouti-related protein; hypothalamic arcuate nucleus

(收稿日期:2014－10－20)

通讯作者:乔跃兵，067000承德医学院研究生处; E-mail: qiaoyuebing@126.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.004

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1135－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 589.25